或者第5步和第6步改为丙酮洗:
5.加入200ul冰冷的丙酮，用手指轻弹EP管，洗去管底和管壁残余的TCA。
6.15000g,离心10－20分钟,倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体。
样品是酵母细胞超声后离心获得的上清，用Loading
buffer溶解蛋白沉淀，始终不能溶解，而且加热超过10分钟以后也依旧不溶解。Typtone做TCA沉淀效果不好，沉淀很多，颜色是绿的，不好溶，Peptone沉淀是黑色的，比较少，一般用丙酮洗一步后很好溶。沉淀不溶，很可能是TCA没有除干净）
ELISA protocol：
用BMMY培养基一般表达1－2天收集表达上清，稀释一定比例铺板做ELISA检测
1.取5－10ul BMMY表达上清用0.05M NaHCO3稀释到100ul铺ELISA板，37度或室温振荡大于1小时。注意一定要做一个GS115空菌株表达上清作为阴性对照，最好还找一个带有 histag的蛋白作为阳性对照。
2.TPBS洗板3次，方法：倒掉铺板液，倒置于毛巾上轻轻拍打几次，加TPBS至满，重复。
3.加封闭液（TPBS加1％脱脂奶粉）350ml/孔，室温下放置40分钟－1小时，TPBS洗3次。
4.加封闭液稀释的histag一抗100ul/孔，ELISA板于室温振荡0.5－1小时，TPBS洗3次。很多公司都有histag的单抗，个人觉得Qiagen和Pharmacia单抗较好，Invitrogen和Labvision的一般般，一般1：1000－5000稀释，不同公司的抗体效价不同。
5.加封闭液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗100ul/孔，ELISA板于室温振荡0.5－1小时，TPBS洗3次。二抗很多公司有，国产的华美都可以，1：500－1000。如果是HRP标记的histag抗体，不加二抗直接显色。
6.加入OPD显色液100ul/孔，避光反应约10－30分钟。显色液配方：1mg/ml OPD于0.1M 柠檬酸钠，PH5.5，0.1%H2O2，－20度避光保存。也可以用DAB显色。
7.1M H2SO4 100ul/孔终止反应，酶标仪测OD490nm。
TCA沉淀考染看不到条带，可以打算作ELISA，但可能上清里面杂蛋白太多，抗原（目的蛋白）不可能包被到板子上，所以几乎不可能检测到的。他们建议作点杂交，就是把少许上清点到PVDF膜上，以后就按照western
blot
就可以了。ELISA使用多抗，意义不是很大，因为确实阴性对照也显色，和阳性结果差不了太多，特别是蛋白表达水平不高的话，两者区别很不明显，一抗是自己制备的多抗,空白值在0.2左右,阴性对照(即空白宿主自身表达的上清)OD值大约在0.35-0.4之间,目的蛋白测的值却在0.6-0.65.可见效果还是比较明显的.因为是多抗阴性对照难免会对结果产生影响.没有单抗也只能这样了.
原位双膜法快速检测阳性表达株：
1） 将醋酸纤维素薄膜置于MD/His -平板的His + 转化子菌落上,用涂布棒轻压使醋酸纤维素薄膜完全湿润并赶尽气泡, 使所有菌落转移到醋酸纤维素薄膜上.
2) 在BMMY板上置一同样大小的硝酸纤维素薄膜, 并将醋酸纤维素薄膜菌落向上置于硝酸纤维素薄膜上. 30 ℃孵育18 h 后, 将醋酸纤维素薄膜移至MDP2His 平板上, 4 ℃保存
3) 将硝酸纤维素薄膜取下, 6 %小牛血清37 ℃封闭2 h , TBS-T ( Tris-NaCl 缓冲液加0105 %吐温20) 洗3
次( 每次10 min) . 加一抗室温孵育2 h , TBS－T 洗膜3 次. 然后二抗室温孵育2 h , TBS2T 洗膜3 次.
最后显色。
在强弱不等的颜色中挑选染色最强的克隆，做诱导表达进一步验证。操作时，一定要记好位置，以免不能将膜上的克隆和板上的克隆对上。
纤维素膜的选择根据？都用醋酸膜行吗？
以后的步骤就基本上是做western，所以用硝酸纤维素膜通过虹吸将醋酸纤维素膜上的菌落分泌的液体转到硝酸膜上，相当于western的转膜过程。
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