关于bcr/abl融合基因的检测方式介绍

　　1、Southern Blot

　　即DNA印迹，可以对bcr-abl融合基因DNA重排进行分子生物学检测。将经限制性内切酶酶切及琼脂糖电泳分离的DNA片段转移到固相杂交膜上，胚系DNA会产生特征性片段，但发生过基因重排的细胞DNA因酶切位点有所改变会产生有别于胚系的DNA酶切片段。大多数bcr基因的断裂点集中于5.8kb的主要断裂点集簇区（M-bcr）。从白血病患者白细胞中抽提的基因组DNA，经一组限制性内切酶消化及琼脂糖凝胶电泳分离后转移到尼龙膜上，用取自M-bcr3’和5’端的bcr探针与之杂交。放射自显影洗片后即可显示所要检测的条带，对于CML患者，除可见到一条与胚系bcr基因组DNA相对应的条带外，其他的条带说明存在重排的bcr等位基因。

　　2、RT-PCR

　　采用异硫氢酸胍酚、氯仿一步法提取细胞总RNA，用RT-PCR技术扩增bcr-abl基因接合区mRNA是检测CML敏感而特异的方法，设计两对引物，先进行逆转录反应合成cDNA，再进行PCR扩增，取扩增后产物10μl，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察结果。

　　3、实时定量PCR

　　PCR扩增时，加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增过程中，Taq酶的5’～3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而使荧光检测系统接受到荧光信号。每个模板的Ct值（即每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数）与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中纵坐标为起始拷贝数的对数，横坐标代表Ct值，然后根据待测样本的Ct值从标准曲线上计算出该样本的起始拷贝数。

　　另外bcr/abl融合基因编码的蛋白P210可以用Western印迹或酶联免疫反应加以检测。