仿制药质量与疗效一致性评价之“杂质测定及对比篇” | 制药行业专题

在“一致性评价”或者仿制药的研发中，仿制药的杂质鉴定及定量检测、原研药和仿制药杂质谱的对比，是化药申报资料中的重要环节，该部分更能体现仿制药及原研药药学研究的专业性。

因此，本章将就杂质的分离、鉴定、定量检测以及基因毒性杂质这几方面内容，来看沃特世如何更好助力杂质检测！

杂质的分离

众所周知，药典只是药品检测的最低标准，在现今集中审评的竞争形势下，如何使企业自身的质量标准更具保护性且更为高效，是值得每一个药企研发部门思考的问题。

在杂质分离方面，国外制药巨头在药物研发阶段早已使用UPLC及小粒径色谱柱多年，在未来的USP药典中也将陆续推出多个UPLC方法，应用于杂质分析和含量测定。UPLC和小粒径色谱柱分别在开发最合适的分离方法、设置技术门槛及提高分析效率方面，都有其独特优势。

以头孢地尼为例，按照药典方法使用方法转换器，将其平行转移至1.7μm色谱柱上，同时将不易挥发的磷酸盐流动相替换成等pH值的乙酸铵流动相体系，其检测谱图如下：

由上图可看出，两个方法的色谱分离情况基本相同，但检测时间由药典方法的60min转变为13min，其分离效率大大提升，同时溶剂成本也大幅度降低。UPLC及小粒径色谱将会是未来制药企业杂质分析方法开发的方向，也将是未来制药企业分析实验室发展的必然趋势。

色谱柱是整个分离的关键因素之一，其化学选择性与分离性能是直接影响样品杂质分离效果的重要原因。下表归纳了市场上获得广泛认可的6款沃特世色谱柱，各自以其独特的优势性能有效应对特定的药物杂质研究工作需求：

*注：UPLC常用粒径亚二微米色谱柱（如1.7μm）；UHPLC常用2.5μm色谱柱；HPLC常用3.5μm、5μm等。

杂质鉴定

在2015版药典附录中明确规定，当药物成分中单个未知杂质的量大于0.1%时，需提供定性方面的资料。随着国家对药品质量的逐渐重视，在未来申报资料中，对未知杂质的研究要求也将越来严格。对超标杂质峰及降解过程中增长明显的杂质峰进行定性鉴定的研究，将会是药企分析部门和审评人员共同关注的问题。

如何对未知杂质进行快速地分析鉴定？针对杂质的结构鉴定，如果没有相关有机分析等知识背景怎么办？最佳解决方案是采用沃特世目前最先进的Xevo G2-XS QTof四极杆-飞行时间质谱仪进行检测，以及使用智能的UNIFI软件进行数据处理。

飞行时间质谱（Time of Flight Mass Spectrometer, TOF）的原理简单说来即是：离子在加速进入漂移管后，以恒定速度飞向离子接收器，离子质量越大，到达接收器所用时间越长；离子质量越小，到达接收器所用时间越短。根据这一原理，可以把不同质量的离子按m/z值大小进行分离，从而计算出准确的分子量，进而推断出分子式及结构式。Xevo G2-XS QTof采用IntelliStart专利模式自动校正质量轴，同时采用LockSpray专利技术进行实时校正，保证采集到的数据准确性，获得质量偏差小于1mDa的准确质量数。采用MSE专利采集方式，一针进样同时获得母离子及碎片离子的高分辨、高质量精确数据，其中包括了母离子扫描、子离子扫描和中性丢失扫描的结果，并且避免了杂质信号的丢失。

再通过软件快速自动确定杂质的相关信息。智能的UNIFI软件自动给出与主峰结构相关的大部分杂质，如降解杂质等。在杂质列表中，可通过左侧的工作流程(workflow)快速筛选出目标杂质。在目标杂质处设上“标签”。以下是UNIFI软件界面，软件中质谱图上处均对应有结构式， 鼠标放在图标上方即可显示。

化合物的杂质中大部分是由降解生成的，所以大部分杂质均为“与主峰结构相关”杂质。特别是对于发酵得到的化合物，其大部分杂质均为相关杂质。

对于跟主峰无关的杂质，可通过使用“Discovery”功能批量导入到在线的chemspider数据库（包含几千万个化合物且实时更新）中进行鉴定，软件同时给出化合物是二级碎片匹配数及化合物索引数，以供参考。同时软件针对精确分子量还可以进行本地数据库，同位素峰匹配、元素组成分析、二级碎片鉴定、反应位点确定、卤素化合物寻找、中性丢失以及共同碎片提取等功能。 

以下为使用Xevo G2-XS QTof及UNIFI软件对头孢地尼实际样品的检测结果摘要：

快速的对原研药和仿制药中的杂质进行对比，UNIFI软件提供了非常好用的对比功能，可直接实现不同样品中杂质谱的对比，快速找出差异组分，并对差异组分进行自动鉴定。如下图总离子流差异比较图中绿色的线条即为差异组分，其中多数组分已自动鉴定。

另外，鉴于药典中多数有关物质检测方法均使用磷酸盐等不挥发性盐流动相体系，如何在这种条件下快速获取杂质的相关信息？使用沃特世UPLC 2D技术可有效解决这一问题。2D二维液相原理：一维使用药典或用户的不挥发性缓冲盐流动相，第二维使用质谱兼容的流动相，将一维感兴趣的峰切入到二维体系中，进质谱进行检测。

例如注射液头孢唑肟钠中杂质的鉴定，一维使用的是磷酸盐等不挥发性盐做流动相，二维使用甲酸体系质谱兼容型流动相，将目标峰切入二维再进入QTof中进行杂质鉴定。

杂质的定量

杂质的定量多数情况下采用普通的液相色谱，对极微量或痕量的杂质可能采用质谱或其他手段进行分析。

在杂质的定量分离检测过程中，采用功能强大的色谱软件系统可以更有效地对杂质进行报告整理。Empower色谱软件系统中自带针对杂质的处理选项，可将杂质进行不同的分类，如降解杂质、空白本底、辅料中的杂质等等，并可对不同的杂质进行合并、扣除等计算及报告。同时，针对不同的杂质，软件可设置不同的杂质限度，也可根据ICH标准设置鉴定、报告及定量限度， 并且在报告中显示各个杂质峰是否超标。

基因毒性杂质

基因毒性杂质（或遗传毒性杂质，Genotoxic Impurity, GTI）是指化合物本身直接或间接损伤细胞DNA，产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能或者倾向。潜在基因毒性的杂质（Potential Genotoxic Impurity, PGI）从结构上看类似基因毒性杂质，有警示性，但未经实验证明。基因毒性物质特点是在很低浓度时即可造成人体遗传物质的损伤，进而导致基因突变，并可能促使肿瘤发生。因其毒性较强，对用药的安全性产生了强烈的威胁，近年来各国的法规机构如ICH、FDA、EMA等都对基因毒性杂质有了更明确的要求，越来越多的药企在新药研发过程中就着重关注基因毒性杂质的控制和检测。

哪些化合物为基因毒性杂质？对基因毒性杂质的法规要求如何？如何设定基因毒性杂质限度？针对这些问题，在沃特世编撰的《如何应对药品中的基因毒性杂质》一书中着重进行了介绍（原文可在Waters.com搜索下载，

相同的化合物检测，使用UPLC代替HPLC，不仅检测速度增加，灵敏度也会大幅提升。下图为使用UPLC/UV检测苯磺酸甲酯（MBS）、苯磺酸乙酯（EBS）、对甲苯磺酸甲酯（MTS）和对甲苯磺酸乙酯（ETS）的结果。在基因毒性杂质的检测中，质谱为最常使用的手段。

沃特世于近年推出的ACQUITY QDa质谱检测器，使用方便灵活。它是一款体积小巧的单四极杆、拥有一般质谱功能，可用于定性和定量； 一键式开关，即开即用型，开机后仪器自动校准，十五分钟真空即可抽好；且维护成本低， 软件参数设置简单，同时利于研发与QC间方法转移。它也可用于基因毒性杂质的检测。

三重四极杆质谱仪在基因毒性杂质检测中应用最多，因其可提供较高的灵敏度。以下为使用沃特世Xevo TQD检测甲苯磺酸的线性0.1～500ng/mL结果。

精彩预告：下期的“仿制药质量与疗效一致性评价”专题，将就生物等效性内容推出精选解决方案，敬请持续关注沃特世公众号！有关专题内容，若有任何建议及想法，也欢迎随时与我们联系！

专题往期回顾：

仿制药质量与疗效一致性评价之“政策梳理解读篇”

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