N-糖谱图在生物制药过程中通常被定义为关键的质量属性，它是衡量疗效、安全性以及生产条件的一个指标。因此，临床和商业化生物治疗制剂的蛋白糖基分析方法是否具有高灵敏度和详尽表征的能力无疑非常重要。除此之外，如果分析方法还能够以快速的运行时间和高通量加快产品开发进程，其优势将更加明显。
使用传统方法制备用于HILIC-FLR-MS分析的N-糖要么费时费力，要么对灵敏度有不利影响。例如，传统的糖基释放步骤所要求的糖蛋白温育时间为1 h，而许多分析人员通常会温育过夜（16 h）。伴随这一过程的是长达2至3 h的标记步骤，这个步骤依赖于还原醛端的还原胺化反应，而这些醛类末端只能在其从糖胺形态水解后才能在N-糖上形成。而对于最常用的标记化合物2-氨基苯甲酰胺（2-AB），得到的蛋白糖基可使用荧光轻松进行检测，但如果要使用电喷雾离子质谱（ESI-MS）检测就相当困难了。
长久以来，人们不断地对传统的N-糖样品制备方法进行改进，但是迄今为止还没有找到一种集简单、高MS灵敏度以及高通量这些期望属性于一身的解决方案。
最近出现了两种用于快速标记蛋白糖基的标记物，其中包括一种可快速标记的氨基苯甲酰胺（AB）类似物。在快速反应中，使用连接脲的氨基苯甲酰胺对前体糖胺的还原性醛端进行修饰。虽然这种快速标记试剂能够加快标记过程，但是它无法提供现代N-糖分析所需的更高的电离化效率。
为了解决上述问题，我们开发了一种样品制备解决方案，该方案能够为蛋白糖基检测提供前所未有的FLR和MS灵敏度，同时还能提高N-糖样品制备的通量。我们合成了一种新型标记试剂，一旦糖胺从糖蛋白上释放，该试剂即可迅速与其发生反应。在仅5 min的反应内，标记试剂RapiFluor-MS将对N-糖进行标记，RapiFluor-MS由N-羟基丁二酰亚胺(NHS)氨基甲酸酯快速标记基团、高效喹啉荧光基团以及可提高电离能力的强碱性叔胺基团组成。为了进一步加快N-糖的制备过程，我们还将快速标记步骤直接与使用了RapiGest SF表面活性剂的快速PNGase F糖基游离步骤集成，并且还包括HILIC µElution SPE纯化步骤，该纯化步骤不仅能够实现对游离的已标记蛋白糖基的高效定量回收，而且还可免去LC-FLR-MS样品分析前的溶剂干燥步骤。
合理设计的新型N-糖标记试剂
我们基于合理设计的考虑合成了一种可以协助进行N-糖分析的新型标记试剂，该试剂能够实现快速标记动力学和高荧光量子产率，而且可显著提高MS检测能力。二十多年前，沃特世推出了一种被称为AccQ•Fluor的快速标记试剂，这种试剂现在已经被广泛用于通过荧光检测准确分析蛋白质样品的氨基酸组成。
AccQ•Fluor具有两个重要的化学特征：NHS-氨基甲酸酯快速标记反应基团和高效的喹啉荧光基团。AccQ•Fluor的这些结构构成了新型蛋白糖基标记试剂的基础。带糖胺的N-糖在蛋白酶的作用下从糖蛋白上被释放之后，该试剂的NHS-氨基甲酸酯反应基团能够迅速对其进行标记。在室温、水相条件下仅5 min的反应中，新型试剂就能完成对N-糖的标记，生成非常稳定的脲链。除了快速标记的能力外，新型标记试剂还能提供极高的MS和荧光检测灵敏度。喹啉荧光基团在该新型试剂中发挥着核心功能，使其能够像AccQ•Fluor一样，实现高灵敏度的荧光检测。这一新型试剂与AccQ•Fluor的不同之处在于它还具有叔胺侧链，这一结构的作用是增强正离子电喷雾电离(ESI+)的MS信号。总而言之，这一新型N-糖标记试剂建立在沃特世丰富的化学试剂专业知识基础之上，具有三种重要的化学结构：快速标记反应基团、高效荧光基团以及强碱性MS活性基团。为了体现出这些出色的属性，这一新型标记试剂被命名为RapiFluor-MS。
RapiFluor-MS可实现高灵敏度检测
我们对RapiFluor-MS的N-糖标记进行了深入研究，特别对比了使用RapiFluor-MS标记的蛋白糖基与使用其它试剂标记的蛋白糖基的响应因子。与RapiFluor-MS最为相似的市售试剂是一种名为Instant AB的氨基苯甲酰胺的NHS氨基甲酸酯类似物。下图A和B展示了源自小鼠单克隆抗体并分别用RapiFluor-MS和Instant AB标记的等量N-糖的HILC荧光和基峰强度（BPI）MS谱图。根据观测到的色谱峰面积，得到了IgG谱图中含量最高的蛋白糖基-岩藻糖基化双触角FA2蛋白糖基的荧光及MS检测响应因子。FA2蛋白糖基的结果表明，RapiFluor-MS标记的蛋白糖基的荧光信号比Instant AB 标记的N-糖的荧光信号高2倍，更惊人的是，它的MS信号比后者高780倍。
RapiFluor-MS(A)和Instant AB(B)标记的、来自完整单克隆抗体质量数检测标准品的N-糖的HILIC-FLR-MS谱图。荧光(FLR)色谱图以橙色表示，基峰强度(BPI)MS谱图用蓝色表示。(C)分别使用RapiFluor-MS和Instant AB标记的蛋白糖基的响应因子(每1 g完整单克隆抗体质量数检测标准品得到的N-糖样品的FA2峰面积)。荧光(FLR)和MS(基峰强度)的响应因子分别用橙色和蓝色表示。重复进行两次分析。
我们通过类似的方法将RapiFluor-MS标记与传统的2-AB标记进行了对比。为了进行对比，分别使用RapiFluor-MS和2-AB标记了源自混合人源IgG的N-糖，并以相同的进样量对其进行了HILC-FLR-MS分析（下图A和B）。考虑到这两种显著不同的方案分别进行了快速标记和还原性胺化反应步骤，我们采用定量标准品进行了外标校准以确定在HILC色谱柱上载量和洗脱的FA2蛋白糖基的量。采用FA2蛋白糖基的校正量确定的响应因子见下图C。我们再次发现使用RapiFluor-MS标记的蛋白糖基的检测信号明显更高，比2-AB标记的蛋白糖基的荧光信号高14倍，比其MS信号高160倍。
RapiFluor-MS(A)和2-AB(B)标记的、来自混合人源IgG的N-糖的HILIC-FLR-MS谱图。荧光(FLR)色谱图以橙色表示，基峰强度(BPI) MS谱图用蓝色表示。使用定量标准品通过两点外标校准对FA2蛋白糖基的量进行校准。(C)RapiFluor-MS和2-AB标记的蛋白糖基的响应因子(通过外标校准确定的每皮摩尔FA2对应的FA2峰面积)。荧光(FLR)和MS(BPI)的响应因子分别用橙色和蓝色表示。重复进行两次分析。
为了汇总上述观察结果，我们以Instant AB和2-AB的响应因子占RapiFluor-MS响应因子的百分比作图，结果如下图所示。从图中可以看出，荧光和MS灵敏度方面的增长是非常明显的，因为该图展示的是根据RapiFluor-MS响应因子进行了标准化的Instant AB和2-AB响应因子。该图中还给出了使用另一种标记试剂（普鲁卡因胺）进行还原性胺化反应的相对性能。普鲁卡因胺是氨基苯甲酰胺的一种化学类似物，近年来，人们利用它来改善使用HILC-ESI(+)-MS分析还原胺化蛋白糖基时的电离效率。之前的研究表明，普鲁卡因胺标记的蛋白糖基能产生与2-AB标记的蛋白糖基相当的荧光信号，而MS信号则比后者高50倍。与普鲁卡因胺相比，RapiFluor-MS在MS在灵敏度方面有相当大的提高。也就是说，新型RapiFluor-MS标记试剂不仅支持蛋白糖基的快速标记，而且还可为分析人员提供无与伦比的荧光及MS检测灵敏度。
蛋白糖基标记的相对性能。响应因子根据RapiFluor-MS标记的N-糖的荧光和MS响应因子进行了标准化。(*)根据已发表的N-糖对比研究结果推测出的对比性结果，已发表的研究结果显示，普鲁卡因胺可提供与2-AB相当的荧光灵敏度，而ESI-MS灵敏度则比后者高50倍(Klapoetke等，2010)。
使用新型Rapid PNGase F和RapiGest SF表面活性剂进行快速糖基释放
RapiFluor-MS标记对N-糖样品制备产生了革命性的影响，它能够和GlycoWorks RapiFluor-MS N-糖试剂盒一起被实验室轻松采用。优化的N-糖样品制备工作流程仅需三步：糖基释放（将蛋白糖基从糖蛋白上释放）、标记（赋予蛋白糖基可被检测的化学基团）以及纯化步骤（去除样品中的潜在干扰物）。传统的N-糖样品制备方法不仅需要漫长的标记步骤，还需要漫长的糖基释放步骤（1到16 h），极其耗时。为了确保RapiFluor-MS快速标记不受耗时的糖基释放过程影响，沃特世与纽英伦生物技术公司合作，共同开发了专为集成快速标记试剂而设计的Rapid PNGase F糖基释放方案。
稳定的定量HILIC SPE
如前文所述，N-糖样品制备的最后一步旨在提取出标记的蛋白糖基以备分析。因此，我们设计了一种使用固相萃取法（SPE）从反应副产物中提取已标记蛋白糖基的有效方法。特别地，该SPE方法是专为从去糖基化蛋白质、PNGase F、缓冲液/制剂组分、RapiGest表面活性剂以及标记反应副产物等组成的混合物中选择性地提取RapiFluor-MS标记的N-糖而设计的，如果未将这些物质去除干净，它们将会干扰标记蛋白糖基的HILC分析。我们提供RapiFluor-MS N-糖分析试剂盒专用的GlycoWorks µElution提取板，它含有专为该应用而设计的硅基氨丙基吸附剂19-22。GlycoWorks SPE吸附剂具有强极性，能够轻松并选择性地保留蛋白糖基之类的极性化合物。此外，该吸附剂具有弱碱性表面，能够基于离子交换和静电场排斥提供进一步的选择性优势。同样值得一提的是GlycoWorks µElution提取板专门针对最小洗脱体积而设计，因而样品无需进行干燥步骤即可马上分析。此外，GlycoWorks µElution提取板为96孔样式，这意味着它可用于高通量实验，或者在低通量实验中连续使用。
结论
使用传统方法制备用于HILC-FLR-MS分析的N-糖要么费时费力，要么对灵敏度有不利影响。我们新开发的GlycoWorks RapiFluor Fluor-MS N-糖分析试剂盒克服了这些缺点，可实现前所未有的蛋白糖基检测灵敏度，同时还能提高N-糖样品的制备通量。该方法可在大约10 min内完成糖蛋白的糖基释放并生成N-糖胺。然后，这些蛋白糖基与新型RapiFluor-MS试剂快速反应，在5 min的反应时间内即可被标记上由高效荧光基团以及能提高荧光及MS检测灵敏度的强碱性叔胺基团组成的标记物。在用时不超过15 min的最终步骤中，通过µElution HILIC SPE方法将所得的RapiFluor-MS标记蛋白糖基从反应副产物中提取出来，这一精心开发的SPE提取方法能够对多种蛋白糖基（从中性到四唾液酸化蛋白糖基）进行定量回收，并且样品一经提取就能立即分析。因此，高灵敏度的RapiFluor-MS标记试剂让分析人员在30 min内即可完成从糖蛋白到待分析样品的N-糖样品制备过程。
首页
