游离氨基酸因极性较大，在反相色谱柱往往没有很好的保留，尤其是涉及LC-MS分析时，受限于流动相体系，我们不得不考虑HILIC模式色谱柱。本应用将介绍在HILIC模式的方法开发中，怎样从色谱柱、流动相、梯度等方面优化方法，获得满意的分离效果。
亮点
异亮氨酸和亮氨酸等化合物基线分离
17种氨基酸峰形对称
HILIC方法优化的步骤解析
实验条件
LC系统：
ACQUITY UPLC H-Class Plus + 柱管理器 + QDa
检测器：
MS全扫（ESI+）
色谱柱：
XBridge Premier BEH Amide 2.1 x 50 mm,2.5 μm (p/n:
186009928)
Atlantis Premier BEH Z-HILIC 2.1 x 50mm, 2.5 μm (p/n:186009985)
柱温：
30 °C
进样量：
1.0 μL
流速：
0.15 mL/min
流动相A：
水
流动相B：
乙腈
流动相D1：
200 mM甲酸铵，pH 3.0
流动相D6：
200 mM乙酸铵，pH 9.0
梯度：
结果与讨论
01.
pH对分离效果的影响
在pH 9.0时，异亮氨酸与亮氨酸未实现分离；在pH 3.0时，Premeir BEH Amdie的整体峰形及分离效果更佳。
02.
梯度调整
注意保持盐浓度恒定。
03.
缓冲盐浓度
使用缓冲盐梯度，可避免缓冲盐在高比例有机相中析出的潜在问题，又通过影响离子相互作用来解决峰形或选择性问题。
*为丙氨酸
结果：
通过考察色谱柱、流动相、梯度等条件，最终得到17种氨基酸的分离条件，可实现异亮氨酸与亮氨酸的基线分离。
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