海光讲堂 | 硒元素形态分析样品前处理技术

元素形态分析的样品前处理不同于传统的总量分析，在前处理方法上需要保持元素的现有形态，因此也不能沿用传统的用于总量分析的酸消解方法和灰化法。元素形态分析的样品前处理一般分以下几个步骤：

① 样品制备及试样的储存；

② 目标分析物的选择性提取；

③ 必要时，形态分离前的衍生化。

样品制备是形态分析过程中的第一个环节，如果样品制备方法不正确，不仅影响到分析结果的准确性，还可能产生错误的结论。在形态分析中，既要求所制得的样品具有代表性，还要求在试样采集、储存和制备的过程中保持其化学形态的完整性。形态分析对试样的前处理过程有着更为严格的要求，而且这一要求也贯穿在后续的分离/分析的全过程中。形态分析涉及的试样主要包括以下几类：1 临床化学试样（血液、尿液和毛发）；2 环境试样（大气及颗粒物、各种天然水样及土壤/沉积物）；3 其它生物试样（包括植物、中草药、食品及动物组织）。

在试样储存及运输过程中，待测元素的化学形态可能会发生变化或造成外来污染，在形态分析中，很难完全避免这一问题的发生。为了防止这一问题的发生，最好进行现场分析或者在试样采集后立即分析。即使试样需要储存时，储存的周期也不宜过长，因为采集的试样在储存过程中由于受到储存容器、材料、光线、湿度及微生物等多种因素的影响，不同化学形态之间的相对比值将可能发生一定程度的变化。应当指出，对痕量成分分析时所采用的制样技术及试样储存方法原则上也使用于元素形态分析。

因为容器材料的不纯或不洁净引起的污染已成为痕量形态分析中的又一个重要问题。因此，用于痕量元素形态分析的容器材料也应是化学稳定性好，纯度高和有适宜的热稳定性的材料。其中，聚四氟乙烯（PTFE）、聚乙烯和熔融石英是优先选择的对象。应当指出，形态分析中的污染具有相对性，这取决于目标分析物的选择。在有的情况下，形态分析的研究目标常常局限于某种单一元素，甚至有时仅要求测量其中的单一化合物。如人尿或血清中甲基汞的测定，这是任何无机汞引起的污染将可以忽视，仅仅要求待测形态物与干扰基体的选择分离即可。容器材料的表面对痕量待测物的吸附也不容忽视，吸附将导致其在溶液中浓度的降低，而且需要不确定的因素都可能对吸附过程产生影响，这些因素是：溶液的pH、共存离子的种类、离子强度以及容器与待测液的接触时间等。

2.1 富硒植物中硒的形态分析（洋葱、大蒜粉、酵母粉等）

（1）热水提取

将5mL去离子水加至0.2g试样中（15mL离心管），让其在沸水浴中加热1h。混合物每15min摇动一次。

（2）酶提取

将5mL去离子水加至0.2g试样和0.02g朊酶中（15mL离心管），然后，在室温下将混合物振荡24h，提取之后，将试样离心和过滤。在注入HPLC体系之前，需将试样酸化（加入60μL 0.5mol/L HCl至300μL试样提取液中）。

2.2 富硒大蒜中硒的形态分析（γ-Glu-MeSeCys、MeSeCys、SeMet、Se(VI)）

（1）水溶液萃取

精确称取干燥的大蒜样品0.2g于带有塞子的聚乙烯瓶中，加入10mL盐酸羟胺溶液。新鲜的大蒜拨皮，称取大约20g蒜瓣，直接加入200mL同样的溶液，均一化样品。样品放入37℃水浴中，磁力搅拌1小时。离心后过滤。

（2）酶萃取

精确称取0.2g干燥的大蒜样品于带有塞子的玻璃管中，加入10mL水和20mg蛋白酶，在37℃条件下磁力搅拌24小时。样品离心后经0.45μm滤膜过滤。

注：酶萃取效率几乎是100%，水溶液萃取的应用主要是查找易发生变化的selenoamino acids。

2.3 天然蘑菇与富硒蘑菇中硒的形态分析(SeMet和未知硒形态)

(1) 水萃取（37℃或85℃）：

精确称取0.2g冻干样品，加入5mL Milli-Q水，样品置于浸没式数字控制自动调温器中，在相应温度下加热1h。

(2) 蛋白酶水解

精确称取0.2g冻干的蘑菇样品，加入20mg蛋白酶和5g Milli-Q水，在37℃条件下反应16h。萃取完后，离心，经0.45μm的滤膜过滤。

注：天然蘑菇采用水萃取程序和蛋白酶水解程序，萃取效率相差不多。富硒蘑菇采用蛋白酶水解程序，萃取效率比水萃取程序高。

2.4 牡蛎组织样品中硒的形态分析(Se(IV)、SeCys2、TMSe+、SeMet、Se(VI))

称取0.25g冻干的牡蛎组织样品，加入10%(w/w)非特征性枯草杆菌蛋白酶，在pH 7.50，37℃条件下，反应24h，重复上述步骤2次，合并反应液，经10kDa定点过滤器超过滤。

2.5 环境样品中硒的形态分析（有机硒）

以甲醇/水(1：1，v/v)或甲醇/水(1：1，v/v)-0.28mol/L HCl或甲醇/水(1：1，v/v)-4% NH₃.H₂O为提取液，置于盛有一定量试样的刻度管中，超声30min后离心，收集上层清液，重复上述过程1次，合并上清液，经0.45μm滤膜过滤，调节pH为7.0左右后测定。

对于非固体环境样品，如尿样，用水精确稀释（1+4）后直接测定。

2.6 沉积物中硒的形态分析（Se(IV)、Se(VI)）

精确称取一定量样品于聚苯乙烯离心管中，加入2mol/L氢氧化钠溶液，超声4h，离心，经0.45μm滤膜过滤，调节pH为7.0左右后测定。

2.7 亚硒酵母片中硒的形态分析（SeCys、Se(IV)、SeMet、SeMeCys）

精确称取1.0g样品于50mL离心管中，加入25mL去离子水，离心管放于沸水浴中加热1h，混合物每15min摇匀1次，萃取完毕，样品离心，经0.22μm尼龙过滤器过滤。

2.8 发酵粉和米粉中硒的形态分析(SeCys、SeMet、SeMeCys、Se(IV)、Se(VI))

精确称取0.4g米粉，加入40mg蛋白酶，20mg脂肪酶和5g Milli-Q水，在37℃条件下反应16h。水解后的样品离心（4000g,45min,15℃），过滤。对于发酵粉，样品量和各种酶的用量都减半。

2.9 尿样中硒的形态分析（SeCys、Se(IV)、SeMet、SeMeCys）

精确量取10mL尿样，加入2mL 3%乙酸，摇5min，用去离子水稀释至25mL。样品离心后经0.22μm尼龙过滤器过滤。

2.10 莳萝中硒的形态分析（Se(VI)、Se(IV)、SeCys2、MeSeMet、MeSeCys、SeMet）

(1)0.1mmol/L HCl萃取

分别精确称取0.25g莳萝的根、茎、叶于玻璃瓶中，加入3.0mL 0.1 mmol/L HCl溶液。

(2)酶萃取

精确称取0.125g根部样品，加入1.5mL去离子水和0.02g蛋白酶XIV。

酸萃取和酶萃取的混合物在室温下搅拌24h。萃取过程中，玻璃瓶密闭，以防污染和萃取溶液蒸发。溶液离心，直到底部看不到颗粒物质。

注：0.1mmol/L HCl萃取小分子硒形态，酶萃取大分子硒形态。

2.11 荞麦中硒的形态分析（Se(VI)、SeMet）

精确称取(300-350)mg样品，加入4mL水或加入50mg非特征性酶蛋白链霉菌（蛋白酶XIV），溶解在4mL 25mmol/L KH₂PO₄(pH 7.50) 缓冲液中。样品在37℃条件下，以200rpm速度搅拌24h。样品在14000g和4℃条件下离心45min。上层清液过滤后测定。 

2.12 富硒细香葱中硒的形态分析(MeSeCys、SeCys2 、SeMet、Se(VI)、Se(IV))

（1）大分子量硒氨基酸萃取

精确称取0.03g蛋白酶K，溶于5mL Tris(pH 7.50)缓冲溶液中，缓冲溶液包含1mmol/L CaCl2。加入0.10g香葱样品，在50℃条件下搅拌15h。然后加入另一种水解酶-蛋白酶XIV（protease XIV），在50℃条件下继续搅拌15h。样品离心后经0.45μm PVDF过滤器过滤。

（2）不含蛋白质硒形态萃取

精确称取大约0.10g样品于玻璃瓶中，加入2.4mL 0.4mol/L高氯酸-乙醇(8:2)溶液。萃取物在3214g下离心10min，离心后样品经0.45μm PVDF过滤器过滤。

（3）硒蛋白的萃取

精确称取大约0.30g样品溶于10mL 30mmol/L Tris-HCl(pH 7.50)缓冲溶液中，缓冲溶液包含1%SDS和2mmol/L PMSF蛋白酶抑制剂。萃取液室温下磁力搅拌24h。溶液在3214g条件下离心25min，收集上清液，加入80%的丙酮，样品在-4℃条件下放置12 h沉淀蛋白质。混合物在3214g条件下离心25min。倒掉上清液，蛋白质重新溶解在1.5mL Tris-HCl(pH 7.50)缓冲液中，缓冲液包含1%SDS。 

2.13 富硒南瓜种子中硒的形态分析(SeMet、SeCys2 、SeMeSeCys、Se(VI)、Se(IV))

精确称取(0.30-0.35)g脱脂样品，加入50mg非特异性酶蛋白酶链霉菌(Protease XIV)，溶解于4mL 25mmol/L磷酸盐缓冲液中(pH 7.50)。样品在37℃条件下，以200rpm搅拌24h。在20℃条件下离心，14000g离心45min。上清液经0.25μm滤膜过滤。

2.14 可食用野生蘑菇中硒的形态分析（水溶性硒形态）

精确称取0.2g冻干样品，加入5g Milli-Q水。混合物在85℃条件下保持1h，样品于15℃条件下离心，以4000g离心45min，经0.45μm滤膜过滤。

2.15 甲壳类动物中硒的形态分析（SeCys、SeMet、Se(IV)、SeEt、Se(VI)）

精确称取0.1g冻干组织样品，40mg非特征性蛋白酶VIII-脂肪酶VII(1：1)于50mL Teflon离心管中，加入10mL水，在37℃阴暗处，以300rpm机械摇动24h。萃取完后，样品在10000rpm下离心10min。经0.45μm滤膜过滤。

2.16 富Se酵母试样中硒的形态分析

称取0.2g富Se酵母试样和20mg朊酶，于50mL聚乙烯离心管中，加入5mL H₂O，在暗处振荡24h。然后，于3000r/min下离心30min。移出悬浮液，经过滤（直径为0.45µm的尼龙膜）后备用。

2.17 低温冰冻生物试样中硒的形态分析

称取1.0g低温冰冻生物试样于50mL离心管中，加入20mL甲醇-H₂O(1+1)混合液；先机械振荡15min，再在2000r/min下离心10min。重复一次，将提取液合并，于44℃下蒸发至干。残渣用1.5mL H₂O溶解，于12000r/min下离心10min。最后，通过0.45µm尼龙膜过滤，滤液用于有机Se的形态分析。

2.18 生物试样中硒的形态分析

称取一定量的生物试样于容器中，加入10mL相应的提取液（H₂O，或2.5% TMAH，或2mol/L HCl），用微波加热（95℃,2h）提取。完毕后，转入100mL容量瓶中，用1%三氟乙酸溶液稀释至刻度。再经0.45µm膜过滤器过滤，滤液用于富硒食品中Se的形态分析。

2.19 尿样中硒的形态分析

为避免污染和减少吸附，尿样宜在-70℃下低温储存。分析前，取体积为(20～200)mL的干冻尿样进行匀化，被匀化的尿样再用超净水1:4处理，然后，通过0.2µm膜过滤器过滤，滤液供LC体系分离/分析。

2.20 富硒大米中硒的形态分析（SeCys2、MeSeCys、Se(IV)、SeMet、Se(VI)）

将富硒大米试样粉碎、均匀，过0.850mm孔径筛，取0.1g放入离心管中，称取10mg链霉蛋白酶E溶于3mL水，加入到离心管中，混匀，37℃超声提取30min.上述提取完成后，10000r/min离心20min，取上清液，过0.22μm有机滤膜，待测。

2.21 富硒大米中硒的形态分析（有机硒）

称取1g米粉，置于三角烧瓶中，加入30mL去离子水，超声振荡30min，于4500r/min离心15min，上清液收集后，倒入分液漏斗中，加入5mL环己烷萃取，收集水相于烧杯中，再按照无机硒处理方法进行消解，测定。硒总量减去无机硒含量即为有机硒的含量。

2.22 茶叶中硒的形态分析（SeCys、Se(IV)、SeMet）

准确称取0.5g样品于15mL离心管中，加入1:1 HCl提取液10mL，混合均匀，超声波超声20min，再在12000r/min条件下离心10min，用0.22μm滤膜的针头滤器过滤上清液后，待测。

2.23 菥蓂中硒的形态分析（有机硒）

准确称取0.5g菥蓂茎样品于烧杯中，加入60mL2次水搅匀，用5%NaOH溶液调节pH值至6.0-7.5。将样品转入100mL分液漏斗，加入20mL甲苯，萃取2min，取其有机相，同样萃取两次，合并至50mL消解罐中，沸水浴蒸去甲苯后按总硒样品处理方法进行消解。

2.24 尿中硒的形态分析（SeCys、Se(IV)、Se(VI)）

尿样离心过滤去除样品中高分子量的物质。在5mL聚乙烯离心管中加入2mL的尿样和2mL超纯水，混合均匀后用0.22μm微孔滤膜过滤，待测。

2.25 尿和硒酵母片中硒的形态分析（SeCys、Se(IV)、SeMet）

尿样品测试当天清晨采样。样品经离心、过滤（0.22μm）后按1:1的体积比稀释后，待测。

硒酵母片采用热水浴法萃取硒化合物；在50mL聚乙烯离心管中加入1.0g硒酵母片和25mL超纯水，置于沸水浴中，每隔15min振荡一次，萃取60min，然后于5000r/min离心20min，取上清液过滤（0.22μm）后备用。

2.26 水产品中硒的形态分析（SeCys、SeMet、Se(IV)）

称取2.0g样品加入10mL 1.5mol/L KOH溶液，2mL甲醇，振荡混匀，沸水浴中加热15min，超声5min，重复2次。待提取结束，加入10mol/L HCl溶液1.5mL，调节pH至6.0-7.0，将混合物4000r/min离心10min，收集上层液体过0.45μm滤膜，加水定容至25mL。

2.27 水产品中硒的形态分析（SeCys、Se(IV)、SeMet、Se(VI)）

准确称取经粉碎过40目筛的干样约0.500g于25mL具塞刻度试管中,加去离子水10mL混匀, 置于70℃超声提取1h, 使试样充分浸提, 取出冷却。4000r/min离心15min, 取出适量上清液用0.45μm 的水系微孔滤膜过滤,待测。

2.28饲料及富硒酵母中硒的形态分析（SeCys、SeMet、Se(IV)、Se(VI)）

饲料及富硒酵母中有机硒的提取：（硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸）

称取一定量的样品，用0.01mol/L乙酸溶液作为提取剂，超声波萃取12h，4000r/min离心10min，取出上清液，并用0.45μm针头式过滤膜过滤。

饲料及富硒酵母中无机硒的测定：

采用HNO₃体系，使用微波消解-原子荧光光谱法对饲料及富硒酵母中的Se(IV)含量进行测定。因为硝酸能氧化Se(Ⅱ)及单体硒为Se(Ⅳ)，不影响Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)，因此对富硒酵母中Se(IV)的定量需减去其中有机硒的硒含量。

2.29 富硒酵母中硒的形态分析（MeSeCys、Se(IV)、SeMet、Se(VI)）

称取0.1g( 精确至0.001g) 富硒酵母于150mL锥形瓶中，加入100mL Tris 缓冲液( 0.1 mol/L，pH 10.0)，漩涡混匀，置于超声波清洗器中超声30min。加入0.2g蛋白酶XIV和0.2g胰蛋白酶，漩涡混匀，置于50℃恒温水浴中酶解48h，期间将锥形瓶取出漩涡混匀数次。酶解完后移取约50mL酶解液至50mL离心管中，4000r/min 离心10min。取1.0 mL上清液至50mL容量瓶中，用超纯水定容，摇匀后过0.2μm水相滤膜，待测。

注：以上样品前处理方法来自文献。

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