多肽类药物分析二三事（四）-反相色谱作用机制

多肽与反相色谱固定相表面的相互作用不同于小分子。对于小分子来说，其分离过程中小分子会在流动相和疏水性的固定相之间进行连续的分配。但是，对于多肽来说，因其分子量一般均较大，很难分配到疏水相中。当多肽随着流动相进入色谱柱后，多肽的“疏水脚”就吸附到固定相的疏水性表面上，直到有机调节剂的浓度达到临界浓度时才会脱附下来，脱附后随着流动相一起流出，它们与固定相表面就只有轻微的作用了。作用机制如图一所示：

图一：多肽与反相色谱固定相表面相互作用的吸附/脱附模型

可以认为多肽是“坐在”固定相上面的，多肽分子的大部分都暴露在流动相中，只有一部分——“疏水脚”与固定相表面接触。反相色谱是基于不同多肽之间“疏水脚”的微小差别来分离多肽的。 “疏水脚”的不同源于氨基酸序列的不同与结构的不同。

由于脱附多肽所需的有机调节剂分子的数目非常精确，所以脱附只在很狭窄的有机调节剂浓度范围内发生。这使得多肽只有在有机调节剂达到临界浓度时才发生突然脱附，否则它们将全部被保留在色谱柱中。多肽脱附对有机相浓度非常敏感，从而使得反相高效液相色谱对多肽的分离具有选择性，能分离非常相似的多肽。当到达临界浓度时，多肽突然脱附并产生尖峰。多肽相较于常规小分子对有机相浓度的敏感性可从下图直观地看出：

图二：组分保留时间与有机调节剂浓度的关系

由图二可知，由于是通过分配而保留，联苯等小分子的保留时间随着有机调节剂浓度的增加而逐渐减少。而对于溶解酵素等多肽来说，尽管在小范围内也遵循随着有机相比例的增加而减少，但是这个范围非常小，由图中橙色曲线的急剧降低可以看出其对有机相浓度非常敏感。这也证实了图一多肽与反相色谱固定相表面相互作用的吸附/脱附的模型。这种由于“疏水脚”而导致的有机相浓度的敏感性，使得反相色谱可以分离仅有微小差别的多肽，包括序列中某一个氨基酸的不同或单个氨基酸取代基不同。

多肽在色谱柱中的吸附/脱附只发生一次。脱附后，多肽和反相柱子表面就没有什么相互作用了，随后的相互作用也不好对分离产生多少影响。

这种相互作用的机制的实际结果是：多肽对有机调节剂的浓度非常敏感。多肽洗脱对有机调节剂浓度的敏感性如图三所示：

图三：溶解酵素在不同有机相浓度下的保留行为

从上图可以看出，小梯度可能比等度更适合多肽的分离分析。

小肽进行色谱分离时分配和吸附同时发生。当有机调节剂浓度变化时，它们脱附的速度比发生分配的小分子要快，但与蛋白质相比，它们是逐渐脱附的。说明其分离机制是混合的。肽的保留时间和侧链疏水性是有关联的，但是由于许多肽的三级结构（空间结构）的限制，这种相互作用只发生在分子中的部分位置上，造成了大部分模型预测的差异。由此可见。螺旋状肽上疏水残基的精确位置，在预测肽的保留值时非常重要。由于大的多肽扩散缓慢，所以其色谱峰要比小分子的宽。等度洗脱的多肽峰是分子量的函数。肌球素等大分子肽的柱效只有联苯等小分子柱效的5%~10%。多肽通常采用梯度洗脱，即使梯度很小，因为与使用等度洗脱相比，出峰更加尖锐。多肽分离很少用等度洗脱的原因也就是其对有机相浓度非常敏感，从分离方法的耐用性上来说，也是梯度更加合适。

在本节的最后，补充一个更加直观的不同分子对有机相浓度敏感程度的图，如下所示：

图四：溶解酵素、苯丙氨酸五肽（小肽）、联苯（小分子）在不同有机相浓度下的保留行为

从上图可知，苯丙氨酸五肽（小肽）的保留时间位于大分子和小分子之间，其曲线的斜率介于联苯（小分子）和溶解酵素之间，其对有机相浓度的敏感区间也介于两者之间，表面其色谱行为是混合的。

对于多肽的保留行为，今天阐述至此。鉴于今天的知识点也可延伸到小分子的离子对色谱中，在后续的章节中会增加一节番外，关于离子对色谱的保留行为，敬请期待！~