25-羟基维生素D，简称25-OH VD，包括25-羟基维生素D2（25-OH VD2）和25-羟基维生素D3（25-OH VD3）作为维生素D在体内的主要代谢形式之一，由于其半衰期长、存在形式稳定而被认为是维生素D营养水平的标志物。
如何快速准确检测人体内维生素D的水平越来越受到广大学者和医患人员的重视。液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）具有特异性强、准确性高的特点，被认为是评价维生素D营养状况的“黄金标准”测定法。
本应用案例采用Cleanert SLE 96孔板进行血清样品前处理，并使用LC-MS/MS进行样品测试，结果表明该实验方法具有良好的稳定性及可靠性，可为临床研究提供一种解决方案。
目标物信息
实验部分
仪器、试剂与材料
主要仪器设备/耗材
·Cleanert M96 生物样品前处理仪
·Cleanert V96 样品氮吹浓缩仪
·Cleanert SLE 96孔板（200mg/well）
·96孔接收板
·Durashell C18-L（3.0*50 mm, 5 μm, 150 Å）
·LC-MS/MS, QTRAP 5500（SCIEX）
试剂材料
·25-OH VD2，25-OH VD3，d3-25-OH VD2
·d6-25-OH VD3；甲醇；甲酸；水；氢氧化钠；异辛烷
实 验
部分
样品处理
样品预处理
取100 μL血清至洁净样品瓶中，加入内标溶液，再
加入100 μL 50 mM氢氧化钠水溶液混匀后待净化。
SLE 过程
上样：把预处理的样品全部上样，待全部浸润后
静置5 min。
洗脱：用2 mL的异辛烷进行洗脱，每次洗脱加入500 μL，最后一步洗脱结束，将Cleanert SLE与收集板整体放到Cleanert M96 生物样品前处理仪上，开启压力至0.05MPa，约10 s，完全收集洗脱液。
将洗脱液室温下用Cleanert V96 样品氮吹浓缩仪进行温和氮吹干，使用200 μL 0.1% FA 甲醇/水（8/2）复溶，进样检测。
实验条件 （HPLC条件）
色谱柱：Durashell C18-L（3.0*50 mm, 5 μm, 150 Å）
流速：500 μL/min
柱温：30 ℃
进样量：5 μL
实验条件 （质谱条件）
扫描模式：电喷雾电离正模式
采集模式：多反应监测（MRM）
实验部分
结果与讨论
实验结果
线性范围与灵敏度
使用不含目标物的血清样品配制7个不同浓度的校准曲线点，25-OH VD3的浓度分别为：2、4、10、60、120、200、400 ng/mL；25-OH VD2的浓度分别为：1、2、5、30、60、100、200ng/mL；所得样品采用上述样品前处理方法净化样品并进行检测，获得结果见表3。
方法精密度与准确度
为考察方法精密度与准确度，取低、中、高三个浓度样本，每个浓度平行处理5个样，获得数据见表4.
将经Cleanert SLE净化的样品按上述LC-MS/MS测试条件进行测试，获得谱图见图3-4.
血样中大量存在的磷脂是造成液质联用基质效应的主要原因，为考察PPT、LLE与Cleanert SLE技术去除磷脂的能力，特取磷脂两对特征离子对进行考察：496/184, 524/184，获得对比图见图5-6.
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结论
本应用呈现了一种简单、高效的样品前处理方法，通过Cleanert SLE 96孔板可高通量净化血样并萃取富集脂溶性维生素D代谢物 25-OH VD2 与 25-OH VD3，本实验方法易操作且稳定，可在临床研究及药物代谢领域替代耗时、低效的液液萃取技术。
实验部分
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