维生素是一类人体不能合成或合成量不足，必须通过直接或间接从食品中摄取的化合物。根据其溶解性差异，可分为水溶性维生素和脂溶性维生素。水溶性维生素通常极性较大，是易溶于水的一类维生素，包括B族维生素和抗坏血酸等。现已知的水溶性维生素是人体组织必不可少的营养素之一，是食物释放能量的关键，也是推动体内代谢，把糖、脂肪、蛋白质等转化为热量时不可缺少的一类物质。它对于维护人体健康、预防及治疗多种疾病有着重要的作用。
由于维生素B对神经系统、消化系统、心脑血管系统、造血系统、生殖系统、视力和皮肤等都有着重要作用，一旦缺乏或者补充不足，以上系统极易出现不良症状。所以需要准确测定人体内的水溶性维生素，才能辅助临床医生进行判断。
但传统的分析方法多为微生物法、分光光度法，这类方法不仅耗时、费力，且已难以满足当前的分析要求和发展趋势。沃特世基于色谱质谱技术的分析方法准确、快速、特异性好等特点，开发了Waters UPLC I-Class Xevo TQD IVD系统，该系统是一种可以快速测定血清样品中的硫胺素（VB1）、核黄素（VB2）、烟酰胺（VB3-NH2）、泛酸（VB5）、4-吡哆酸（PA）、吡哆醛（PL）、生物素（VB7）、叶酸（VB9）和5-甲基四氢叶酸（5-MTHF）的定量分析方法。
图1.ACQUITY UPLC I-Class + Xevo TQD IVD超高效液相色谱质谱联用系统
极性大、保留弱、稳定性差、非特异性吸附是水溶性维生素的分析难点，针对以上特性，采用Atlantis Premier BEH C18 AX Column 2.1*100mm，2.5 μm（Part No. 186009378），样本前处理采用蛋白沉淀法，建立了快速测定血清样本中9种水溶性维生素硫胺素（VB1）、核黄素（VB2）、烟酰胺（VB3-NH2）、泛酸（VB5）、4-吡哆酸（PA）、吡哆醛（PL）、生物素（VB7）、叶酸（VB9）和5-甲基四氢叶酸（5-MTHF）的定量分析方法，分离谱图见图2。
图2. 9种水溶性维生素分离谱图
针对水溶性维生素稳定性差的问题，考察了提取后的血清样本在样品管理器（SM）放置12 hr、50 hr后的稳定性，结果显示，在放置12 hr和50 hr后，所有化合物的稳定性因子在0.87-1.17之间（图3），说明提取后的样本在样品SM中放置50 hr内是稳定的。
计算方法（以0 hr为标准）：
12 hr稳定性结果计算：
12 hr Peak Area/ 0 hr Peak Area
50 hr稳定性结果计算：
50 hr Peak Area/ 0 hr Peak Area
图3. 处理后的血清样本在SM放置12 hr、50 hr后的稳定性结果
准确定量是生物样本分析的关键，对此，还考察了混合血清基质做加标计算加标回收率，分别添加低、中、高三个浓度的混合标准品，作为低、中、高浓度的质控品。其中VB1、VB2、PL、VB9、5-MTHF的低、中、高加标浓度分别为3、10和30 ng/mL；VB3-NH2、VB5、PA 的低、中、高加标浓度分别为10、30和100 ng/mL；VB7因为在正常血浆中的浓度非常低，所以低、中、高加标浓度分别为0.3、3和30 ng/mL，结果见表1：
表1：血清基质加标回收率结果
考察了经前处理后的6种血清基质S1、S2、S3、S4、S5、S6的基质效应。将样本前处理后S1-S6与50 mM的乙酸铵水溶液分别添加标准品和内标。计算其绝对基质效应，结果见图4(A)，计算经同位素内标校正后的相对基质效应，结果见图4(B)。可见9种水溶性维生素在不同血清中的绝对基质效应差别较大，基质因子在0.41-1.18之间。
图4. 血清基质与溶剂分别加入标准品和内标后计算的（A）绝对基质效应和（B）内标校正后的相对基质效应（上下滑动查看更多）
但是经过同位素内标均一化校正后9种水溶性维生素的相对基质因子在0.85-1.15之间，所以同位素内标可以很好地校正在不同血清中基质效应，保证定量结果的准确性。
综上所述，样品前处理采用蛋白沉淀法，操作简便快速，且加标回收率在85% - 115%之间；经过同位素内标均一化校正后的9种水溶性维生素的相对基质因子在0.85-1.15之间；经过处理后的样本在管理器中放置50 hr后稳定因子在0.87-1.17之间，保证了样品检测的准确性和稳定性。
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