随着Flash应用的广泛深入，反相C18的纯化分离正变得越来越普遍，与此同时，如何根据分离样品的性质开发出对应的分离方法正变得越来越重要。如果我们借用正相分离方法的思维进行方法开发的话，问题就会变成：我们需要借助反相TLC进行方法开发，这样流程和原理几乎和正相一致，通过TLC得到的数据来进行方法转换。然而反相TLC薄层板有其限制性：
1.由于其是C18基质所构建，使用之前需要进行活化，而当用纯乙腈活化之后，残留的溶剂会和摸索的流动相混合，从而导致最终得到的数据不正确；也可以通过多次润板将相互混合的误差降低到最低，然后如此操作之后会导致巨大的时间浪费，得不偿失。
2.反相C18 TLC板的成本往往很高，商业推广的难度会比较大。
因此目前来说，通过TLC薄层板进行反相Flash方法开发并不是目前主流的方法。
对于反相Flash方法的开发，我们会给您推荐使用HPLC进行方法开发，如果您使用的色谱柱以及其填料和Flash接近，其得到的方法会非常直接和简单。
使用HPLC进行方法开发
在知道为什么我们会要选择HPLC进行方法开发的原因后，接下来我们将为您介绍如何进行实际的方法转换。
简单来说就是在HPLC上尝试到所需要的梯度方法，然后将这个方法（间接）复制到Flash设备上即可，此处之所以我们提到“间接”这个词，是由于HPLC和Flash之间的色谱柱规格以及其填料往往不同，两者的方法之间无法之间复制，需要做一些转换，具体怎么进行转换呢？下面我们用实际的应用案例给大家分享相应的经验。
为了说明他们之间的方法转换所面临的的挑战，我们会用同一个方法在HPLC和Flash进行分离和对比，从而让您看到两者之间的对比。
下表1为HPLC以时间为单位的梯度分离方法，
Time
%MeOH
Flow rate (mL/min)
05514551249012690126
100
132
100
1
表 1. HPLC梯度分离方法
下图1 为HPLC图谱分离方法和谱图，可以方法样品得到了很好的分离，其所使用的色谱柱为：Phenomenex Gemini® (4.6 x150 mm, 5 µm)，随后我们将同样的方法转移到Flash上。
图1. 反相HPLC梯度分离方法和谱图，溶剂体系为水和甲醇，上样量：1.667ug。
由于Flash是以CV柱体积为单位进行的方法分离，因此在建立方法时，我们需要将HPLC的时间转换为Flash的CV柱体积。图中峰1为第一个柱体积出来所出现的峰，其保留时间为1.82min，流速为1 mL/min，因此其CV值为1.82mL,随后将时间转换成CV值后的方法如下表2：
CV
%MeOH
Flow rate (mL/min)
055125511290112901
13.01
100
116
100
1
表 2. HPLC转换成CV值方法表格。
随后，我们将此方法输入到Bioatge Isolera 系统当中，选择了12gC18 Flash色谱柱进行放大量的分离制备纯化。
图 2. 通过HPLC得到的Flash方法
在上样量为100mg的情况下，得到了图3的分离谱图。结果表明Flash 对其中每一种组分都形成了有效的分离，当然，相对于HPLC，其分离效果还是稍逊一筹。不过有意思的地方在于其第三个色谱峰的分离效果反而比HPLC更好。
图 3. 通过HPLC方法进行的Flash分离谱图
从此次对比实验的结果表明，HPLC可以直接当成反相Flash方法开发的通道，同时之间也存在着一些相似性和差异性，实际的应用中我们并不能直接复制到Flash当中去，为了避免填料的差异性，最佳的方案是通过一根装有相同填料的HPLC色谱柱进行方法开发，这样可以最大程度的降低柱效的差异性，从而可以直接进行方法复制。
然而在在很多实际情况中，能够准备好一个相同填料的HPLC分离色谱柱是一件非常奢侈和不易的事情，大部分的研发实验室并不能满足这样的条件，这时候，该怎么办呢？
其实从以上直接转移的结果报告可以发现，Bioatge C18的色谱柱对应与HPLC柱效的衰减，并不严重；相反由于其25um全球性填料的特质以及高度统一的均一性，导致其在有些样品的分离效果异常出色（组分3），很多情况下，HPLC条件下分离开的样品，往往稍加修改和调整即可得到很好的分离效果。
此种方法的调整和修改往往需要很多次方法的经验累积，由于从5um或者10um的C18转变成25um的C18填料时，其分离度和柱效的变化是具有规律和固定性的，同时HPLC色谱柱的保留时间往往都会高于Flash色谱柱，因此在实际的应用中，当确定好HPLC的方法后，转换到Flash系统时，其流动相中有机相的比例可以整体向下调整15%左右，具体数值因样品以及经验作可以做相应的调整。举例：HPLC的方法为30min，30%-50% 乙腈/水, 流速1ml/min，CV=1.82mL；转换成CV值后，其方法即为16.5CV，梯度比例可以适当调整为15%-30%，流速使用对应型号的色谱柱推荐的流速即可。注意：此处最终如果按照整体下移15%的话，最终的梯度比例应该为35%，然而我们选择了30%，是因为我们希望梯度更缓一点，没有那么陡峭，进一步保证样品可以成功分离，由于Flash可以实时在线编辑方法，随时修改任意分离参数，因此起始的时候，可以保守一点设定方法，随后在实际使用过程中根据实际出峰情况在进行微调即可。
可以发现以上使用经验进行方法设定的时候，存在着诸多不确定性以及在实际分离过程中需要实时关注产品的分离情况，增加使用成本和不可预见性，有其短板。
因此，我们认为目前市面上最优秀最便捷的方案仍然是使用装有相同填料的HPLC分析柱进行方法开发，然后再直接复制到Flash上即可。
关于反相Flash方法开发，如您有相关建议和疑问，欢迎您留言讨论。
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