在之前的文章中，我们讨论过多种反相Flash制备开发方案，最终我们认为通过装有中压C18填料的分析HPLC色谱柱进行方法摸索后，再转移到Flash当中，是当前最可靠最快捷的方法开发之一，此次我们将为您实际的应用案例分享，为您解决在实际方法转移中遇到的问题。
Biotage提供专门的反相方法开发分析柱，通过此色谱柱和HPLC的联用，可以轻松摸索出Flash制备方法，节省时间，节约溶剂。值得大力推广。
由于将分析的色谱柱填料和制备Flash Sfär C18色谱柱填料保持了高度一致，因此在进行方法转移的时候，仅需将分析图谱上X轴的时间的长度单位转换成以CV为标准的数值即可，这让快速纯化的过程变得简单和高效。
下图为我们使用的HPLC色谱柱，Selekt中压制备系统以及配套的Sfär C18色谱柱。
我们将通过两组实际样品的实验来验证我们推荐的方法转换的准确性，具体样品如下：
亲水性化合物（图1）和亲脂性化合物（图2），两组差异较大的样品可以保证此种方法覆盖范围的广度。
由于HPLC分析和Flash制备的条件需要一致，因此HPLC柱温箱的温度，我们设定的和Flash一致，即室温25℃。
具体实验方法如下：
◆HPLC 分析方法：
(1) 亲水性化合物
样品浓度: 2 mg/mL（in water）
色谱柱: Biotage® Scaling Column 4.6 mm ID x 25 cm[Part No. S1UL-0401-93050]
柱温箱温度: 25℃
进样量: 3µL
流速: 1.0 mL/min.
溶剂: A) water B)MeOH
梯度: 10% B (1CV) → 10-100% B (3CV)→100% B (2CV)
(2) 亲脂性化合物
样品浓度: 4 mg/mL（in MeOH）
色谱柱: Biotage® Scaling Column 4.6 mm ID x 25 cm[Part No. S1UL-0401-93050]
柱温箱温度: 25℃
进样量: 2.5 µL
流速: 1.0 mL/min.
溶剂: A) water B)MeOH
梯度:: 25% B (1CV) → 25-100% B(10 CV)→100% B (2CV)
◆Flash 中压制备系统 - Biotage®Selekt 分离方法
(1) 亲水性化合物
样品浓度: 2 mg/mL（in water）
色谱柱: Biotage®Sfär C18 D 12 g [Part No. FSUD-0401-0012]
进样量: 5 mL
流速: 12 mL/min.*
溶剂: A) water B) MeOH
梯度: 10% B (1 CV) → 10-100% B (3 CV)→100% B (2CV)
(2) 亲脂性化合物
样品浓度: 400 mg/mL（in acetone）
色谱柱: Biotage® Sfär C18 D 12 g [Part No.FSUD-0401-0012]
进样量: 0.5 mL
流速: 12 mL/min.*
溶剂: A) water B) MeOH
梯度: 25% B (1 CV) → 25-100% B (10 CV)→100% B (2CV)
＊Sfär C18 D 12g色谱柱的默认流速为12 mL/min
在进行方法转移时，需要将分析色谱柱的时间转换成与之相对应的CV柱体积即可。
HPLC的流速设定为典型的1m L / min，Selekt中12g的反相色谱柱的推荐流速为( Sfär C18 D 12g ) 12 m L / min。
亲水性化合物尿嘧啶和咖啡因的混合物的色谱结果如图3所示，亲脂性化合物对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丁酯的混合物的色谱图结果如图4所示。
图3：尿嘧啶和咖啡因混合物HPLC分析和Flash分离谱图
图4：对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丁酯混合物的HPLC分析和Flash分离谱图
从以上方法转化结果可以发现，不管是对于亲水性样品还是疏水性样品，转换之后的谱图都显示出了非常强大的一致性。样品之间的分离度都得到了有效的延续，这也直接证明了使用相同填料进行统一方法开发的有效性。在亲脂性样品的放大试验中，Flash的实际载样量比HPLC的分析试验中增加了5000倍，但其分离度丝毫不受影响。
从完美的分离结果可以发现，在反相Flash的开发当中，通过在HPLC中使用相同填料的分析柱Biotage®Scaling Column 4.6 mm ID x 25 cm[Part No. S1UL-0401-93050]进行分析方法开发，之后再直接转移到Flash设备上，分离变得异常高效，具有普遍应用意义的价值，值得尝试。
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