前两期,我们以最常见的“十八烷基硅烷键合硅胶”为例,为大家解释了:键合相、键合方式、填料基质、以及它们各自对色谱分离和柱寿命的影响。
除了以上这些影响到填料色谱性能的化学性质,大家还需要了解填料与色谱柱的一些物理参数,这些参数会影响到色谱柱的柱效、分离度、载量等性能,也是大家在选购色谱柱时,需要报选的参数。
① 粒径(μm)
② 孔径(Å)
③ 全多孔与实心核(表面多孔)颗粒
色谱柱内的填料通常为球形颗粒(注意!早期品牌还有不规则形状颗粒),以粒径衡量填料颗粒大小,如HPLC柱的3.5/5 μm到UHPLC的2.7/2.5 μm以及UPLC柱的1.6/1.7/1.8 μm等。同一色谱柱品系下,通常有不同的粒径供您挑选。
在做方法提速时,通常会选择小颗粒色谱柱,但并不能说填料颗粒粒径越小,柱效就越高,还需要同时比较色谱柱的长度:色谱柱柱效水平正比于色谱柱柱长,反比于填料粒径。柱效水平相当是HPLC/UPLC间方法转换成功的前提。
填料粒径越小,对于色谱柱供应商的柱填装技术能力要求也会越高。另外,同样流速下,小颗粒色谱柱的柱压会明显高于HPLC色谱柱。
球形填料颗粒上,密密麻麻地分布着很多孔。如下图所示,孔约占填料表面99%空间,这些孔的存在很重要,它们为填料提供了更高的表面积,能够增加色谱柱的分析载量。一般来说,孔径越小,填料比表面积越大,载量越大;但是,如果分析物的分子量比较大,或者空间直径比较大时,就需要选择较大的填料孔径,以便于分析物的扩散传质速度,降低色谱峰宽。
填料颗粒表面的孔
Tips
小分子化合物:分子量低于2,000时,不需要考虑孔径问题,常见色谱柱孔径范围90~150Å都可以使用。
分子量较大时,例如肽(分子量4,000以上)、蛋白,或者有空间展开直径较大的PEG链修饰的小分子或小肽时,通常优先考虑较大孔径的填料,例如300Å。
在使用GPC分析药用辅料分子量分布,或者SEC分析蛋白或抗生素的聚集体时,填料的孔径是非常重要的选择依据,能够直接影响到分离效果。
不同孔径填料的电镜示意图
市场上的主流色谱柱多为全多孔颗粒,这种填料结构能够提供最大的表面积与载量。但随着对分析效能与速度的要求,在主流色谱柱中也逐渐增加了一个重要成员:实心核颗粒。与相同规格其他填料色谱柱相比,可提供更高的柱效。但是实心核填料在提高柱效的同时,分析载量则会因为表面积减少而下降。所以,大家要根据自己的项目特点来进行选择和取舍。
Tips
沃特世几乎所有的色谱柱系列都是全多孔填料颗粒,如大家耳熟能详的ACQUITY UPLC BEH/CSH/HSS、XBridge、XSelect、 Sunfire等等;而Waters的实心核(表面多孔)填料颗粒CORTECS家族分别有1.6 μm UPLC和2.7 μm HPLC,在2013年首次推出CORTECS UPLC时,曾因为其卓越的柱效以及对柱压的出色控制而获得R&D100年度大奖。
比如对极性化合物有较好保留的T3柱,既有全多孔(Atlantis T3/HSS T3)又有表面多孔(CORTECS T3)的填料,该如何选择?可参考如下:
知识小结
选购色谱柱时,应根据项目的各方面因素考虑如下参数:
方法规定的是什么键合相?或者,这个项目需要什么样的键合相(以及分离模式)会比较合适?
这个分析条件,需要用什么样的填料基质与键合方式才会比较耐用?
需要根据分子量大小选择孔径吗?
需要提高速度和通量吗?根据柱效正比于L/dp,来选择合适的粒径与柱长。
全多孔vs实心核,分别具有载量vs柱效的优势,根据项目情况来进行选择。