凝胶洗手液中微生物的荧光快速检测方法

最近疫情的大流行使凝胶洗手液(免洗洗手液)等日常卫生用品需求激增。微生物快速检测技术有助于加快这类产品的上市，因而受到了广泛的关注。

洋葱伯克氏菌(BurkholderiacepaciaATCC^® 25418)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC^® 6538)

选择金黄色葡萄球菌是因为它在一半人口的皮肤上天然存在，并记载于EN 13727-2012中(医疗领域杀菌活性评估的定量悬浮试验—试验方法和要求)。⁴

初步试验表明未经处理的洗手液由于凝胶稠度而无法过滤。因此用100mL Fluid A(常用的微生物稀释剂)稀释10g洗手液。

在EZ-Fit ^®过滤系统上无菌操作安装过滤装置。将上述制备的100mL样品倒入过滤装置并过滤。过滤后从装置中取出滤膜，无菌操作转移至90mm TSA琼脂平皿32.5 ℃.培养。培养时间取决于所用方法:EZ-Fluo^™系统快速检测法的菌落大小必须足以发出足够强度的荧光信号，而再培养传统平皿法上的菌落必须肉眼可见且易于计数。

将冻存菌液在室温下解冻,并用NaCI蛋白陈缓冲液连续稀释,制成10至100 CFU的100uL溶液。

荧光法基于酶促反应检测。所用发光底物是一种不发荧光的活性标记物,经细胞内广泛的非特异性酶分解后产生荧光信号。荧光在细胞内累积后自然放大，代表微生物能进行代谢活动，继而证明为活细胞。染料用染色缓冲液稀释以增强细胞膜通透性。而由于缓冲液被细胞吸收,荧光染料被稀释。

用1.7mL染色液预先润湿液体培养基吸收垫，并在小培养皿中将滤膜从琼脂转移到吸收垫上。培养皿在32.5 C培养30分钟。再将含滤膜的培养皿置于EZ-Fluo^™读数器，进行荧光菌落计数。

选择进行的再培养步骤可使微菌落继续生长，便于后续鉴定。将滤膜从培养皿转移至新的琼脂平皿，以剩余的标准培养时间继续培养。

适当的培养时间指回收率高过传统法菌落数的70%所需的最短时间。

两种回收率计算方法为:

最适培养时间必须积聚足够强度的荧光信号。荧光方法和再培养回收率都不得低于70%。

为了评估产品的抗菌性，在样品中添加菌悬液(10至100CFU的金黄色葡萄球菌或洋葱伯克氏菌)并过滤。传统培养后没有观察到任一试验菌的菌落,证明洗手液具有强抗菌性。

进行两次冲洗中和程序评估抗菌效力:用100mL Fluid A 冲洗滤膜一到两次。

用100mL Fluid A冲洗—次足可清除滤膜上的残留抗菌剂，使微生物生长水平与不含产品时相同，洋葱伯克氏菌回收率达97.5%。用100mL Fluid A再冲洗一次后的回收率为同一水平(洋葱伯克氏菌回收率达98.8%)

某些产品可能诱导荧光背景导致结果呈假阳性，妨碍EZ-Fluo^™系统实现准确的菌落计数。因此洗手液基质需要进行荧光背景试验。

过滤试样，取滤膜在TSA琼脂平皿上培养。将滤膜染色并用EZ-Fluo^™读数器观察。TSA琼脂平皿和Fluid A 均不会产生荧光背景,若有荧光背景必定来源于产品。

最终没有检测到任何荧光背景，证明洗手液并不会造成荧光背景。

为了确定快速检测法中的平皿培养时间，过滤样品并在冲洗液中添加菌悬液(10至100 CFU的金黄色葡萄球菌或洋葱伯克氏菌)。添加相应试验菌的Fluid A(不含洗手液)作为对照。

根据之前的内部研究，将金黄色葡萄球菌的快速培养时间定为16.5小时(见图1)。

注意:每一次测定的CFU菌落数为5次重复的平均值。

图1:金黄色葡萄球菌的CFU菌落数:培养16.5h并染色的EZ-Fluo^™检测法,培养21.5h的再培养平皿和传统法平皿。洗手液基质称为样品。

样品的荧光回收率为106%(样品CFU占传统法菌落数的百分比)，样品的再培养回收率为100%，两者均远超70%的指标。

洋葱伯克氏菌的EZ-Fluo^™系统快速检测的培养时间未知。鉴于EZ-Fluo^™系统的培养时间通常缩短至传统方法的一半至三分之一，已知 USP 60规定洋葱伯克氏菌增菌后的培养时间为48小时,因而选择16、20和24小时的培养时间进行试验。16小时后没有观察到任何荧光菌落,24小时后菌落过大以至难以计数。20小时后的荧光菌落可见且易于计数,根据此培养时间微调，加增18和22小时试验。部分滤膜图像见表3。

22小时后的菌落过大,18小时后的菌落大小刚好适合简单计数。因此选择18小时作为洋葱伯克氏菌EZ-Fluo^™系统检测的最佳培养时间。菌落数见图2。

注意:每一检测的CFU菌落数为5次重复的平均值。

图2∶洋葱伯克氏菌的CFU菌落数:培养18h并染色的EZ-Fluo^™检测法、培养2天的再培养平皿和传统法平皿。洗手液基质称为样品。

全部检测表明荧光法和再培养的回收率均符合上述快速检测法指标。实际上，荧光法测定的样品洋葱伯克氏菌回收率达98%,再培养测定的达99%。

作为微生物含量检测工具，EZ-Fluo^™荧光技术可缩短凝胶洗手液产品的微生物污染检测时间。在试验条件下，金黄色葡萄球菌可在16.5小时后检测，洋葱伯克氏菌在18小时后检测,只占传统法培养时间的1/3。另外,由于快速法检测是非破坏性的，每个受检的荧光微菌落都可再培养，继续生长产生可见菌落,便于使用任一传统鉴定法鉴定污染物。

因此,EZ-Fluo^™荧光技术可加速产品推出市场,缩短库存时间,最终节约企业成本。

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