蛋白沉淀是生物样本前处理中最常用的方法。尤其是在DMPK和BE实验中，由于待测物质的浓度较高，简单快速的蛋白沉淀法就可以满足大批量样品上机检测的需要。
但是，当蛋白沉淀法不能满足实验要求时，是不是应该选择更复杂的固相萃取法呢？其实，我们不妨试一下操作跟蛋白沉淀一样简单但净化效果更好的ISOLUTE® PLD+ 蛋白沉淀除磷脂板。
最近小编接到了一个客户的咨询，客户反映实验用的样本进行蛋白沉淀后，无论是使用过滤还是离心的方式都无法得到清澈透明的样品。
在拿到客户提供的样本后，小编先按照标准的蛋白沉淀实验流程，沉淀剂:样本为3:1的比例先向蛋白沉淀板中加入了450 µL的乙腈，再分加入150 µL的实验样本，混匀并静置5 min后进行正压、收集。
图1. 蛋白沉淀处理后的样本，左为客户样本（高磷脂），右为普通人血清
如图1所示，实验样本呈略带荧光色的乳白色溶液，无明显的固体悬浊物。再次将样本通过孔径为0.2 µm的过滤板后，样品的颜色和状态都没有明显的变化（图2）。可以判断，并不是因蛋白沉淀不完全而存在的颗粒造成样品浑浊，而是乳化形成的胶体使样品呈现乳白色。
图2. 左侧为高磷脂样本蛋白沉淀处理后，右侧为蛋白沉淀处理后再经0.2 µm过滤板过滤
小编推断造成这个现象的“罪魁祸首”可能是磷脂。血液中有丰富的磷脂类物质，主要参与构成生物膜，进行各类物质的转运。磷脂分子具有极性和非极性两亲基团，具有乳化剂和表面活性剂的作用。如果样品中磷脂含量偏高，磷脂分子包裹极性化合物形成胶体束，会导致样品形成乳白色浑浊。同时，磷脂也是采用ESI离子源进行质谱分析中造成基质效应的主要干扰因素。
为了验证这个推断，小编对蛋白沉淀处理的样品进行了冷冻破乳。在冻融之后，乙腈和水分层，变得澄清透明，但在两相交界处出现了明显的乳化层（如图3）。
图3. 经冻融后，样品澄清分层，在交界处出现乳化层（左为冻融前，右为冻融后）
此时，就是ISOLUTE® PLD+ 发挥作用的时候了。ISOLUTE® PLD+ 蛋白沉淀除磷脂板在蛋白沉淀板的基础上增加了针对性吸附血液中磷脂成分的填料，除了具备蛋白沉淀板的功能外，更可以高效去除样品中的磷脂成分，毫不费力地提高方法灵敏度和重现性。使用ISOLUTE®PLD+ 对客户的样本进行前处理后，乳化的现象消失，样品澄清透明，可以满足LC-MS/MS的上机要求（如图5）。
图4. ISOLUTE® PLD+ 工作流程
图5. 使用ISOLUTE® PLD+ 处理后的高磷脂样本（右瓶）
磷脂成分除了会造成样本乳化外，还会与液相色谱柱功能基团结合，造成柱压升高、柱效下降、色谱峰形变差等问题。同时，由于样本中大量磷脂成分的存在，会导致目标化合物在ESI离子源内离子化效率降低、信号响应变弱，即更强的基质效应。
磷脂类化合物具有特征性的m/z 184 产物离子，通过监测该离子可评价样品前处理方法对磷脂的去除效率。图6所示为通过蛋白沉淀和ISOLUTE® PLD+两种前处理方法下，磷脂类化合物的信号强度。其中蓝色信号为蛋白沉淀处理，红色信号为ISOLUTE® PLD+处理，通过ISOLUTE®PLD+处理后，样品更干净，基线更稳定，从而带来更高的灵敏度。
图6. 不同前处理方式磷脂信号强度，蓝色为蛋白沉淀，红色为ISOLUTE® PLD+
相关装置和耗材
名称货号
ISOLUTE® PLD+蛋白沉淀除磷脂板
918-0050-P01
ISOLUTE® FILTER+ 0.2 µm超效过滤板
120-2000-P05
Biotage® 96孔正压萃取装置
PPM-96
关于Biotage
Biotage（BIOT, NASDAQStockholm）是一家致力于解决社会问题的全球影响力科技公司。我们为药物发现和开发、分析测试以及水和环境检测方面的客户提供工作流程解决方案和产品。作为全球专业的样品前处理方案提供者和行业领先者，Biotage为生物样品分析前处理提供专业的自动化处理平台、耗材以及方法开发，如Extrahera全自动样品前处理系统、TurboVap全自动氮吹浓缩仪、ISOLUTE和EVOLUTE样品前处理耗材等，帮助我们的用户提高工作效率的同时也显著改善了生物样品分析实验的数据质量。
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