图1.教科书上[1]的反相色谱保留时间和pH的关系图
对这图1上的pKa的指认的质疑也引起了国内很多科学家的思考。比如有科学家认为目前拿出来的实验数量太少，证据显的单薄，也有科学家认为这个是因为流动相是酸性有关物质是碱性，走梯度的时候，有机相比例增高pH在降低，导致物质的pKa移动到了保留时间变动的中心。这都是令人鼓舞的讨论。同时也被建议能不能深入研究，投稿高水平的期刊，让同行评议。
logD-pKa的关系早有定论，只不过这个pKa±1“黄金规则”的问题没被拿出来仔细讨论，或者被认为不必要。2009年Po-Chang Chiang和 Yiding Hu用RP-HPLC的色谱数据用高通量策略快速测量和计算化合物的logD,pKa[2]。其中所依赖的公式如下，即pKa点的logD为分子态的logP减去常数0.301。
以及
图2.美托洛尔的logD曲线和pKa的拟合和计算
在图2里引用一下Po-Chang Chiang对美托洛尔的研究的图片，显然pKa是不在logD曲线的中间。因为对一般有机物来说，其在普通C18色谱柱上logD和logk呈线性关系，即logk=a+blogD，其中a,b是常数，而logD曲线因此可用化合物的保留时间来变换和拟合。因此logD的变动区就是保留时间的变动区。在图2可见6-9这个pH范围logD变化最为剧烈，所以应当规避。
在2006年，Pawel Wiczling等人发表了用HPLC梯度方法测量和估算pKa和亲脂性的文献[3]。
表1.梯度的设定，C通道和D通道里分别是3M的氢氧化钾和1M盐酸
图3.按照表1的双梯度测定得实际的pH值变化趋势
因为使用了梯度5-80%的甲醇作为有机相放在B通道内，作者担心走梯度时流动相的pH会发生变化，因此而用了双梯度，C通道是3M的氢氧化钾，D通道是1M的盐酸，按照其Table1的比例进行现混。对混合后的pH值进行测量，获得了9个实验，从1-9，pH值依次降低。
图4.对8个化合物的混标进行9个pH下的20分钟梯度实验保留时间叠合结果
化合物分别是1.乙酰氨基酚;2.苯巴比妥;3.对氨基苯甲醚;4.华法林;5.哌唑嗪;6.双氯酚酸;7.氟哌啶醇;8.异丙嗪
表2.8个化合物混标的色谱峰-保留时间-实测pKa标记。彩色线表示某化合物的保留时间拟合，红点表示PubChem记录的pKa。
在表2里的化合物几乎都是单电离化合物，非常适合直接观察。在拟合图形里，明显能看出pKa点不在保留时间的变动中心。表格里最令人感兴趣的两个化合物是3.对氨基苯甲醚p-anisidine pKa 5.36的弱碱，以及5.哌唑嗪Prazosin pKa 6.54的碱。从图形上看，感觉的确弱碱的pKa靠近保留时间变动中心。由于表2中的图形是斜视图，观察不变，而Pawel Wiczling在文献里提供了直角坐标系的数据，如图5。为了方便比较和观察，将图形根据实际情况做了标记处理，如图6。
图5.Pawel Wiczling原文的18个实验的数据
图6经过重新标记的直角坐标系实验结果，Series 1 是20分钟梯度的结果，Series 2是60分钟坐标系的结果。3号，5号化合物的保留时间曲线用蓝色和绿色标记，实测pKa用圆圈标记。
虽然这个坐标系和日常观察比较的坐标系是反的，但依然能看到，这两个弱碱的pKa点几乎就在疏水变动的中心。也就是说，图7-1的施耐德先生标记的pKa是对的，而我指出的pKa是错的。在同一个实验里，其他化合物的pKa是有明显偏置现象，而其他化合物的种类包含弱酸，强酸，强碱。也就是说施耐德先生用在弱碱（苯胺，吡啶）做出来的实验结果外延去分析弱酸，强酸，强碱时就会有偏差，但在弱碱上使用就是对的。因此施耐德先生在图7-2里的烟碱的分析就外延使用了在弱碱上获得的经验而发生了错误。
图7-1.施耐德先生在《现代液相色谱导论》的图7.2 pKa指定是正确的
图7-2.施耐德在《现代液相色谱导论》7.3图猜测的烟碱pKa点和实际pKa点
也就是说这个pKa
±1黄金规则要细化如表3.
表3.化合物类型以及对应的疏水保留时间变动期
经过以上的文献数据的比较，终于将这个变动区的情况进行了较为系统的分析，算是了结了一段公案。然而被分析的物质远远不止是单电离的状况，结构越复杂电离情况就越复杂。例如刘国柱博士提供的双电离化合物如图8可见是强酸弱碱化合物。
图8.阿奇沙坦的pH扫描保留时间叠图，阿奇沙坦为双强酸弱碱物质
因此寻求保留的稳定，应当参考预测的logD曲线，例如图9的阿奇沙坦的logD图型与实验数据较为吻合。
图9.阿奇沙坦的logD曲线图
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感言：
昨天（2022年6月2日）是萧柏明博士的67岁生日，众弟子都到南京祝贺，而我受疫情的影响受困于上海家中不能与兴，深感遗憾。谨以此文作为贺礼向萧老师表示生日祝贺。感谢萧老师引领我等企业药物分析领域的学生学习和奋进。
祝各位读者端午安康！
参考文献：
[1] 现代液相色谱导论 第三版 Liyod R.Snyder等第7章节
[2] Simultaneous Determination of LogD, LogP, and pKa of Drugs by Using a Reverse Phase HPLC Coupled with a 96-Well Plate Auto Injector . Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 2009, 12, 250-257
[3] Simultaneous Determination of pKa and Lipophilicity by Gradient RP HPLC Paweł Wiczling, Piotr Kawczak, Antoni Nasal, and Roman Kaliszan* Anal. Chem. 2006, 78, 239-249
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