再谈规避pKa±1的规则

上篇文章《pKa的黄金规则探讨》写的不够充分和透彻，令大家徒增不少困扰，所以熬夜再写一篇。力求把观点说清楚，论据讲透彻。

图1.教科书上的反相色谱保留时间和pH的关系图

这是现代液相色谱导论的第七章离子样品中的图7-2，作者提出像苯胺或者吡啶这样的pKa约等于5的弱碱性的化合物，在pH足够宽的时候，其pH-保留时间作图会出现S形。作者将2-8的范围内划分为三个区域，其中I区和III区是保留稳定区，II区为保留受pH影响很大的区域，略微的pH变化就能够很大程度上改变保留时间。II区的中心点被定位pKa点，其变动范围±1就是经常提到的规避范围。由于施耐德先生实在是影响力太大，我猜测这个pKa±1规则就是从这里来的。

从图1上来看II号区域的范围是一个保留时间变动区，规避这个范围非常有必要，如果主峰色谱峰出在这个变动区里，出峰时间将非常不稳定，这样基于相对保留时间的RRT对杂质进行定位会面临极大的困难，为生产和检验工作带来很大的麻烦。

图2.pKa点不在pH-保留时间变化的中心处，而应偏向于分子态

我认为图7.2体现出施耐德先生可能存在一个认知上的错误。他认为图1是pKa为5的弱碱跑出来的pH-保留时间曲线。我的看法是，对于这样的曲线，这个碱性化合物的pKa不是5，而是要比5高不少。此时这个保留时间的变动区应该描述为pKa到pKa-2或者pKa-3。也就是说对于碱性化合物来说要规避的pH范围是其表观pKa，也就是最强碱性pKa以及pKa-2或者-3这个范围。

图3不同性质的化合物的保留时间拟合曲线，保留时间来自于图(b)(c) (d)( e)

组分1水杨酸，组分2苯巴比妥，组分3非那西丁，组分4烟碱，组分5甲基苯丙胺

分别为强酸，弱酸，中性，弱碱，强碱的代表，色谱条件不再赘述

我们看一下在同一章节的图7.3，也就是本文图3的内容。这是对5个典型化合物的保留时间同pH之间关系的分析和重新作图，研究点设定在pH 3，5，7，9用软件来拟合保留时间曲线。在《现代液相色谱导论》原文中，施耐德先生认为保留时间随pH上升而显著延长的必定是碱性化合物（化合物4，5），而保留时间随pH上升而缩短的则是酸性化合物（化合物1，2），而保留时间随pH上升变化不大的则是中性化合物（3）。作者推断4号化合物的pKa为6.5，而5号化合物大于9，因为实验只做到了pH 9，对5号化合保留会如何变化就没有数据了。我们把眼光就专注于4号化合物，分析一下这个6.5的判断对不对。

图4.烟碱的pH-保留时间曲线

将图形做简化，去除其他物质，只保留烟碱的图形，在图上用黑色竖线标记了施耐德先生估算的pKa值6.5。可以看出，这种判断的策略同图1的判断策略一脉相承。都是取了保留变化的中心点为pKa。然而烟碱的pKa不是6.5，有很多资料可以拿来查阅和比较。

图5.烟碱的pKa预测分析，ACD/Percepta pKa 预测值

图6.来自于PubChem尼古丁词条下的pKa文献数据

图7.施耐德猜测的pKa点和实际文献的中心点

烟碱就是尼古丁，这个化合物被研究的很清楚，图6显示在PubChem的尼古丁词条下查到的pKa真正的碱性化合物的pKa点文献数据为8.11，8.1和8.5，图5为ACD/Percepta pKa 预测值最强碱性pKa为8.3,这些值都不在pH-保留时间曲线的变动中心点。如图5所示尼古丁的预测pKa是8.3和3.2，分别来自于叔胺和吡啶上的氮原子。第二碱性pKa对保留虽也有影响，相对于最强碱性pKa对保留的影响要差很多，在这张图上基本不产生影响。

到这里，我用施耐德书籍里的资料和实际的数据向读者展示了我的看法，我认为施耐德先生提出的规避pKa±1的说法其实是一个错误。原因是他判断错了碱性化合物的pKa点。

接下来我们对刘国柱博士做过的pH扫描数据再进行一次解读。

图8.对某碱性化合物的pH扫描实测图形叠合图

这是刘国柱博士在实验室用多流路的安捷伦筛选系统做的从2到11.3的pH扫描图，收集这个化合物的所有谱图来比较分析。能看到这个化合物的保留分成两个稳定期，一个变动期。从结构上来分析，这个化合物有两个碱性解离基团，一强一弱，预测最强碱性pKa来自于脂肪胺，pKa为8.0，芳香吡啶环上的氮的pKa预测值为2.1。这一结构特点与烟碱的pKa分布很接近，都是一强一弱，而且好处是做的足够宽，将图3的pH宽度不足的问题弥补了。

我们从保留时间的稳定性来进行探讨。图8实验的数据，以保留时间pH作图，图形是一个S型，如图9所示。这个图形和图10的logD和pH作图相关性很高，这说明物质保留的主要的作用力就是疏水作用力。

图9.刘国柱实验pH和保留时间相关性图

图10.碱性化合物的典型的pH-logD曲线

图11.pKa与logD曲线同坐标系下分析

将pKa和logD曲线的预测图在同一个坐标系下关联起来，可以看到pKa点的确就不在logD变动区的中心上，而在靠近分子态的一侧。这是因为pKa点上的疏水性与分子态的疏水性更接近，与离子态的疏水性相差甚远。pKa点上的疏水性大小可以快速估算，等于分子态的logD减去log0.5，因为在pKa点上只有50%的分子态，另外50%是离子态，离子态的疏水性相较分子态非常低，忽略不计，而log0.5约为0.3，pKa电上的logD疏水性比分子态下降0.3，反相保留略微减弱。而从图8上可以看到，pKa点向左约3个pH单位到pKa点的范围内logD的变化剧烈，也就是说真正的保留时间的快速变动期是发生在当前pKa向左约3个单位的范围内。

再从峰形上进行考察，最强碱性pKa附近的色谱峰，pH 8.2的色谱峰峰形很好，同旁边pH 9.2-11.3的三个pH下的峰形几乎不相上下。从色谱峰的稳定性来说尚可接受。再看pKa左侧的色谱峰，明显pH 7的峰形质量下降了，而5.8下降的更厉害，酸性越强，峰形越差。

我们发现可电离的碱性化合物在它不带电荷的状态下峰形最好，带50%电荷的时候，峰形也尚可，带电荷的比例越高峰形就越差，峰高也降低。等到化合物完全电离，则色谱峰呈超载的直角三角型状态。这种现象实际是带电化合物完全电离后的与色谱柱的吸附能力大大降低而导致的现象。完全解离的碱性化合物超载质量远远低于中性化合物，约为1比50，图12的去甲替林的案例也说明了这一点。

图12.完全电离化后的去甲替林的超载峰形态,从右到左为0.01-5ug去甲替林的峰。色谱方法：150mm*4.6mm(3.5um) Xterra MS C18柱 28%ACN 20mmol/L 甲酸 pH2.7

总结一下，碱性化合物的峰形跟pKa没有什么直接关系，跟化合物的带电荷的状态有关系，完全电离的碱性化合物峰形往往较差。如何在酸性条件下修饰碱性化合物的峰形，事实上有很多手段，可以从色谱柱，修饰峰形的添加剂，温度等手段着手，我们在这里不做展开。

还有人有过这样的顾虑，在pKa附近开发方法是不是特别容易出双峰，其猜想是因为分子态和离子态比例很接近，所以容易出两个峰。物质的分子态和离子态其电离速度是非常快速的，快到纳秒级别，因此根本就不可能用色谱观察到分子态和离子态的区别。不存在某一部分永远带电，一部分不带电荷。如果是固定不变的带电状况，带电的那些的保留会很弱，分子态的保留会很强，这两者分别能出峰的话，其保留时间将相差很远。现实并非如此，因此双峰另有原因。

结论：

延申讨论一个复杂的分离问题如下：

图13.四个苯甲酸衍生物和三个苯胺衍生物的logD和pKa分析

要对图13里的7个酸碱化合物进行分离，当要pH选择时，会碰到极大的困难。图里面红色的区域正好是7个化合物的pKa的集中区域。假设中心点为4，对4个碱性化合物，也就是pH 1-4之间是4个碱性化合物的敏感区，对3个酸性化合物来说pH 4-7之间是酸性化合物的敏感区。而pH 7以上这3个酸性化合物保留有困难，logD都到了-2的水平上了。这个方法怎么做？此时应选出主目标物，照顾主目标物的保留相对稳定，其他的色谱峰不稳定也就先不照顾了。

在这个pH-logD的图里还有一个信息。对于苯甲酸这种强电离物质，其疏水性不稳定区域的范围约3个pH单位（绿色范围）甚至还多，对于苯胺这种弱电离物质不稳定区域大约是2个pH单位（蓝色范围）。

以上就是对pKa的黄金规则探讨的进一步的阐述，希望引起更多的讨论和更深入的认知。接下来我们可以找一些典型的化合物，做一系列的宽幅pH扫描，来证明这一点。

写在最后，对于单一化合物来说，追求好峰形和稳定保留，则pH选择的pKa的规则是：