BD Rhapsody助力肿瘤抗体药开发——具有特异性持久记忆效应

吉凯基因

2022.11.09

作者吉凯基因

TA的动态

单细胞测序技术在肿瘤抗体药研究中起到越来越重要的角色，今天小编为大家分享一篇发表在PNAS（IF=11.205）上题为CCR8-targeted specific depletion of clonally expanded Treg cells in tumor tissues evokes potent tumor immunity with long-lasting memory的文章，揭示了相关肿瘤特异Treg细胞的靶点CCR8，并给药验证且发现具有特异性的长期记忆效应。

background

背景介绍

Foxp3调节性T细胞(Treg)参与维持免疫自我耐受和内稳态的过程，但在肿瘤组织中的大量存在会阻碍患者的抗肿瘤免疫反应，选择性清除多克隆肿瘤Treg将激发有效的肿瘤免疫。但肿瘤浸润Tregs的很多细胞表面标志物，也普遍表达在激活的传统T细胞（Tconv）中，让科研人员难以针对肿瘤反应性Treg精准治疗。为了建立更安全有效的靶向Treg的癌症免疫疗法，需要进一步挖掘其独特分子标志物，区别于肿瘤反应性效应Tconvs和natural Treg（nTreg）。

experimental methods

实验方法

样本：

人源：肿瘤组织来自于肾癌、鳞状非小细胞肺癌、结直肠癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌或黑色素瘤患者中外科切除。外周血来自肾癌患者或健康供体；

小鼠：植入CT26.WT结肠癌、Renca肾癌或EMT6 乳腺癌细胞系。

单细胞测序：

BD Rhapsody靶向转录组试剂盒（T Cell Expression Panel Hs，633751）

流式技术：

BD FACSCantoII、FACSAriaII、FACSAriaSORP、FACSAriaIII

experimental conclusion

实验结论

小鼠的克隆扩增肿瘤Treg特异性标记物的鉴定

作者为了寻找在肿瘤组织中克隆扩增Tregs特异性表达分子，而不是肿瘤浸润Tconvs或nTregs特异性表达，利用流式、单细胞测序（小鼠模型）、Bulk测序技术，分析发现只有CCR8共同表达在小鼠多克隆肿瘤Tregs和人肿瘤Tregs中。在流式水平上(图1C)，CT26肿瘤中表达CCR8的Foxp3+细胞占比很高，肿瘤引流区淋巴结（DLN）和远端淋巴结(LN)中很低，只有少数Foxp3-CD4+ Tconvs在肿瘤组织和LNs中表达CCR8分子。

与CCR8- Tregs相比，肿瘤CCR8+ Tregs绝大部分Treg功能相关分子的表达更高，似乎是更活跃和终端分化的（S3A）。

人肿瘤浸润Treg细胞中CCR8的表达

接下来，作者通过BD Rhapsody靶向转录组单细胞测序比较了肾癌、肺癌、结直肠癌、卵巢癌、膀胱癌等患者肿瘤组织与健康供者外周血中的CD3+ T细胞，分析了CCR8在人肿瘤浸润T细胞中的表达。发现肿瘤Treg主要表达CCR8，而肿瘤Tconvs和健康供者外周血中的nTreg几乎不表达该分子（图2A、2B、S4A、S4D），这些CCR8+ 肿瘤Treg在流式蛋白水平上高度表达Treg相关分子（图S4C）。

流式分析同样显示，在肾癌(图2E)、胃癌(~ 40%)、膀胱癌(~ 80%)、黑色素瘤和结直肠癌(图S6A)中，CCR8由~80%的肿瘤FOXP3+CD4+ T细胞表达。除结直肠癌外，肿瘤FOXP3-CD4+和CD8+ Tconvs在这些癌症中几乎不表达该分子。

为了确定CCR8+ Treg是否在人类肿瘤中克隆扩增，作者分析了乳腺癌、肺癌、子宫内膜、结直肠和肾癌的浸润T细胞的TCR测序和scRNA-seq的公开数据，与CD8+或CD4+ Tconvs相比，Treg中CCR8+细胞的频率确实更高(图S7A、C、D)，CCR8表达在克隆扩增的Treg中显著上调(图S7B、F)。

通过消耗小鼠CCR8+ Treg来根除肿瘤

作者在小鼠皮下接种癌细胞系后一段时间，静脉注射抗CCR8单抗，发现超过½小鼠的肿瘤完全缓解(图3A)。并进一步实验确认了该抗肿瘤作用是由于CCR8+ Treg的缺失，作者修饰了CCR8抗体的Fc段，使其不具备ADCC活性，发现不能消除肿瘤，而未被修饰Fc段的CCR8抗体，可以消除肿瘤Treg细胞，说明CCR8抗体通过ADCC作用消除了CCR8+ Treg细胞 (图3B-D) 。

基于抗PD-1疗法在肿瘤治疗中的重要性，作者比较了抗CCR8和抗PD-1的效果，将CT26肿瘤细胞系植入小鼠中，发现~90%肿瘤浸润Foxp3+细胞为PD-1+，其中约60%表达CCR8，而约60%的肿瘤CD4+或CD8+ Tconvs为PD-1+(图3E)，抗CCR8和抗PD-1联合效果最能抑制肿瘤生长(图3F)。

CCR8+ Treg缺失不产生有害的自身免疫

为了确定CCR8+ Treg的缺失是否会引发自身免疫炎症，作者对整个Treg系统性缺失或受抗CCR8依赖性Treg缺失的小鼠进行了研究。分别用人白喉毒素（DT）和抗CCR8让小鼠肿瘤Treg细胞缺失（图4A-B），发现在DT处理组中，小鼠脾脏肿大（图4C）、自身免疫标记高滴度（图4D）、组织被破坏（图4 E），而抗CCR8治疗方式中，未出现明显破坏（图4C-E）。作者还发现CCR8+细胞缺失减少了肿瘤Treg的主导TCR克隆型。

CCR8+ Treg缺失产生肿瘤特异性持久T细胞记忆

实验表明，在接种CT26肿瘤细胞系后的~第20天，抗CCR8治疗的小鼠已经完全缓解，在第85天用10倍数量的CT26癌细胞向小鼠发起挑战，另一组接种CT26的小鼠在第20天接受手术切除生长的肿瘤，并同样接受CT26癌细胞的挑战(图7A)。惊喜地发现在CCR8治疗组，CT26肿瘤被迅速摧毁（图7C），即使在原发性CT26肿瘤接种后延长了约187天，也得到了类似的结果，这表明该治疗方式能产生持久记忆。