推文前言
众所周知,粒细胞是一群非常脆弱的细胞,也是目前很多单细胞RNA测序平台很容易丢失的一类细胞。BD Rhapsody单细胞多组学技术,基于微孔和自然沉降原理对单细胞进行分离捕获,无额外压力刺激,对细胞更温和,可实现高通量和高效率捕获。
今天分享的文章是近期发表在Nature Immunology(IF=20.5)期刊的“CD66b−CD64dimCD115− cells in the human bone marrow represent neutrophil-committed progenitors”,作者通过联合BD流式和单细胞多组学技术对骨髓CD66b−CD64dimCD115−的中性粒定向祖细胞(neutrophil-committed progenitor cells,NCPs)进行了系统性研究,结果发现NCPs存在4种处于不同成熟阶段的细胞亚群,且可通过2条不同的分化途径定向分化为CD66b+的中性粒细胞。最后通过比较转录组和表型特征发现,NCPs较之前报道的“早期中性粒前体细胞”更为幼稚。
技术亮点
BD Rhapsody单细胞多组学与流式技术:
1
BD Rhapsody单细胞多组学分析系统
2
BD Rhapsody人样本标签试剂盒
3
BD Rhapsody 全转录组扩增试剂盒
4
BD 流式分析仪LSRFortessa X-20
5
BD 流式分选仪 FACSAria Fusion
6
流式数据分析软件 BD FlowJo v10
研究背景
已知粒细胞的发育包含从造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)/多能祖细胞(multipotent progenitors,MMPs)→常规髓系祖细胞(common myeloid progenitors, CMPs)→常规粒-巨噬细胞祖细胞(common granulocyte-macrophage progenitors,cGMPs)→粒-单核-树突细胞祖细胞(granulocyte-monocyte-dendritic cell progenitors,GMDPs)→早幼粒细胞(promyelocytes,PMs)→中幼粒细胞(myelocytes,MYs)→晚幼粒细胞(metamyelocytes,MMs)→杆状核粒细胞(band cells,BCs)→分叶核粒细胞(segmented neutrophils,SNs)→外周成熟中性粒细胞(peripheral mature neutrophils,PMNs)等一系列复杂的过程。虽有研究通过单细胞组学鉴定出人中性粒的各类前体细胞,但这些前体细胞都表达CD66b和CD15,其分化水平更趋近于PMs,而非更早的祖细胞。此外,有报道在小鼠的cGMPs中鉴定到最早的中性粒祖细胞CD34+Ly6C+CD115− Pro-Neu1s。基于此,作者拟通过流式和单细胞多组学鉴定人骨髓中的NCPs。
向下滑动查看所有内容
研究结果
1
BD流式细胞术助力粒细胞定向前体细胞NCPs发育
01
BD流式细胞术鉴定cGMPs亚群
为了鉴定出比早幼粒细胞更幼稚的中性粒定向祖细胞,采用流式抗体Panel对骨髓中低密度的细胞进行分析,发现SSCloLin−CD45dimCD10−CD38+亚群不同程度地表达CD34和CD45RA,其中CD34+CD45RA+的亚群也是CD135+,为cGMPs;通过CD123,CD65和CD115将其进一步细分为5个细胞亚群(1A):
02
体外实验鉴定CD34+CD45RA+CD64dimCD115−亚群为中性粒定向前体细胞
流式分选出该细胞亚群、cMoPs和MDPs,分别进行体外培养。流式分型结果显示CD34+CD45RA+CD64dimCD115−细胞亚群极大部分分化为CD66b+的中性粒细胞,极少数分化为CD14+单核细胞(1B)。
此外,通过表型和形态鉴定,发现CD34+CD45RA+CD64dimCD115−亚群在体外培养7天分化的中性粒细胞大多为幼稚中性粒细胞(1D,1E),培养至14天则可完全分化为成熟的中性粒细胞。
以上结果表明,CD34+CD45RA+CD64dimCD115−亚群为中性粒的定向前体细胞。
03
BD流式细胞术鉴定其他NCPs亚群
有研究发现NCPs也存在于CD45RA−的亚群中,为此通过BD流式细胞术对低密度的SSCloCD45dim亚群进行深入分析,发现可通过CD34和CD45RA将CD64dimCD115−的NCPs分为4个亚群:
• NCP1s: CD64dimCD115−CD34+CD45RA−
• NCP2s: CD64dimCD115−CD34+CD45RA+(1和2中介绍)
• NCP3s: CD64dimCD115−CD34dim/-CD45RA+
• NCP4s: CD64dimCD115−CD34dim/-CD45RA−
流式分选出以上亚群,并对其形态和发育潜能进行研究,发现CD34+和CD34dim/-的NCPs为早幼粒细胞的“上游”细胞,且表达不同水平的CD45RA。
04
NCP1s和NCP2s体外培养可独立分化为中性粒细胞
为研究NCPs的发育过程,分选上述4种NCPs分别进行体外培养,流式分析表型,发现NCP1s(CD34+CD45RA−)可通过下调CD34的表达而直接分化为NCP4s(CD34dim/-CD45RA−);而NCP2s(CD34+CD45RA+)则是先下调CD34的表达分化为NCP3s(CD34dim/-CD45RA+),随后逐步下调CD45RA的表达分化为NCP4s,最后都分化为CD66b+的中性粒细胞(3A,3B)。
2
单细胞转录组研究助力NCP发育谱系及轨迹分析
01
转录组测序发现NCPs比早幼粒细胞PMs更幼稚
通过Bulk-RNA测序,对NCPs,HSC/MPPs,CMPs,PMs,MYs,MMs,BCs,SNs,PMNs进行转录组特征分析(PCA分析)发现,NCPs的转录水平位于CMPs和PMs之间,且NCPs各亚群之间相互聚集(4A),其CD34和PTPRC(编码CD45)基因的转录水平也与流式结果一致(4B,4C)。
02
转录组测序和表型分析证实NCPs为eNePs,human proNeu1/2s和COVID-19 proNeus的“上游”细胞
为验证NCPs是否位于最近文章报道的eNePs,human proNeu1/2s和COVID-19 proNeus的“上游”,作者将NCPs PCA基因与已发表的转录组数据进行比较,发现NCPs比eNePs,human proNeu1/2s和COVID-19 proNeus在转录水平上更为幼稚。且用流式表型分析验证了此结果。
03
BD单细胞多组学揭示NCPs异质性和发育轨迹
为精确剖析NCPs转录组的异质性,流式分选出NCP1s、NCP2s、NCP3s、NCP4s和cMoPs,混样试剂盒SMK对其分别标记后,上样BD Rhapsody单细胞平台,最终捕获17902个细胞,其分析结果如下:
1)
从非线性降维UMAP图中可看出,NCPs与cMoPs的转录水平存在明显差异,而NCPs之间分界不明显(7A)
2)
Seurat无偏倚聚类分析将细胞亚群分为9个Clusters(C1~C9)(7B),其中C1~C4为NCPs亚群(表达中性粒相关的基因,CEBPE,GFI1,ELANE),C5~C6则为cMoPs亚群(表达单核细胞相关基因,IRF8,CSF1R,FLT3)(7C)。
3)
分析C1~C4在各NCPs中的占比发现,NCP1s和NCP2s具有相似的C1~C4占比,且以C1为主;NCP3s和NCP4s具有相似的C1~C4占比,但以C3为主;此外,C2在各NCPs中的占比基本一致(8A)
4)
通过R语言Destiny函数包计算NCPs中每个细胞的拟时间值(8B),并评估他们的成熟程度,结果发现C1亚群以更幼稚的细胞为主;C3和C4则以较成熟的细胞为主,而C2则介于两者之间(8C);此外,CD34主要表达于C1和C2亚群,与NCP1s和NCP2s的表型相吻合(8D)
5)
用Seurat对C1~C4的差异基因进行分析,并鉴定出136个关键基因。其中C1高表达未成熟的Marker基因(CD34, TOP2A,TUBB),C2高表达干扰素刺激基因(ISG15,IFI16,IFIT3),而C3和C4则高表达嗜天青颗粒相关基因、中性粒活化和脱颗粒相关基因(8E)
6)
通过拟时序评估C1~C4潜在的发育轨迹,发现其存在3条分支,其开始于C1并分化出2种发育轨迹:
轨迹1为从C1到C3和C4的分化,其涉及的基因与中性粒细胞颗粒酶相关(TOP2A,CSTG,BEX1),因此被成为“常规发育轨迹”;轨迹2为从C1到C2的分化,其涉及的基因大多为干扰素刺激基因(IFI6,IFITM3,IFIT3),因此被成为“干扰素刺激发育轨迹”(8E~8H)
以上数据表明,NCPs存在转录组异质性,且可通过2条不同的分化轨迹进行发育。
向下滑动查看所有内容
全文总结
在本研究中,作者充分利用流式联合BD Rhapsody单细胞多组学技术势对骨髓来源的NCPs进行研究,结果发现NCPs可分为4种处于不同成熟阶段的细胞亚群,并通过2条不同的分化途径定向分化为CD66b+的中性粒细胞,且较之前报道的“早期中性粒前体细胞”更为幼稚。该方法为后续研究其他细胞发育轨迹、异质性和表型等提供了重要的研究思路。
单细胞多组学平台
BD Rhapsody™
BD Rhapsody™ 单细胞多组学分析系统能够对成千上万个单细胞的蛋白与基因进行数字定量,提供灵活的定制化Panel及标准化应用方案,以满足不同的实验需求,其独特的混样技术可有效节约时间与成本。
系统组成包括:
BD Rhapsody™ 扫描仪
BD Rhapsody™ 上样台
BD Rhapsody™ cartridge(微孔板)
分子标签试剂和文库制备
全转录组检测试剂盒/靶向RNA检测试剂盒/定制试剂盒
Abseq蛋白检测试剂盒
多样本混样检测试剂盒
VDJ检测试剂盒
单细胞测序数据分析软件BD SeqGeq
1.实验技术干货
2.蛋白质组学研究
3.腺病毒简介及应用
6.单细胞测序
8.悬浮细胞专用病毒
10.测序技术研究与应用
12.腺相关病毒选择/应用
13.表观遗传研究
14.文章解析
15.国自然课题设计思路解析
16.生物信息分析及工具
17.外泌体研究
18.肿瘤免疫研究
19.高分文章
20.吉凯病毒神经方向应用案例