CNS顶刊！BD Rhapsody教你如何做脑科学单细胞研究！

吉凯基因

2022.5.18

作者吉凯基因

TA的动态

人的大脑其实极其复杂，仅仅占据我们人体小部分的大脑，却包含着千亿个神经元，相互之间还存在着令人难以捉摸的复杂联系，但这并不能阻碍科学家们被她的神秘所吸引。面对如此“精密”的器官，如何高效对其进行多方位研究，一直是众多科学家们头疼的问题：

大众化的方法如免疫标记（immunostaining）或是流式细胞术（flow cytometry, FACS）等虽奏效，但可同时研究的参数却十分有限；

当在没有特定分子标记的先验知识时，关键的干细胞以及神经祖细胞群会很难分离；

早期的单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）极易受到低细胞数量的限制。

BD Rhapsody单细胞多组学分析系统的诞生，轻松解决以上脑科学研究中存在的技术难题。

该系统是目前唯一可在同一次实验中获得转录组、蛋白组、免疫组库（VDJ）和多样本分析结果的单细胞平台，丰富的多维度参数让脑科学的研究更加深入和全面；

BD Rhapsody特有的DNA分子标签包含多达88万种细胞标签（Cell Label）及约750万种基因标签(Unique Molecular Index)，能在单细胞水平上，对每个细胞、每个基因同时进行精准标记，高效分离干细胞及神经祖细胞群；

相较于早期的低通量单细胞RNA测序方法，BD Rhapsody 具有更高的细胞通量和灵敏度，基于经典的微孔板（Microwell-based）原理，单次实验可分离100-40000个细胞，同时，该平台对细胞悬液浓度的要求可低至40个/ul，对于脑科学研究中的一些微量样本如脑脊液等也同样适用。

正因为如此，「BD Rhapsody单细胞多组学分析系统」已成为「脑/神经」单细胞研究的最佳拍档，帮助科学家们发表了多篇高分文献。本文选取了近年来最具代表性的几篇文献，与大家一同回顾——

No.1

人类大脑皮层的发育涉及到神经元的迁移整合。来自美国斯坦福大学的研究团队利用一种3D分化方法，在培养皿中成功诱导神经球（neural spheroid）定向发育成大脑皮层球状体（human cortical spheroids, hCS）以及大脑皮层下球状体（human subpallium spheroids, hSS），并将两者在体外进行组装，以促使细胞迁移和人脑皮质回路的发育。为全面表征hCS和hSS单细胞的转录组信息，研究人员利用了BD Rhapsody，在其分化的第105天将11,838个hCS或hSS结合并酶解成单个细胞，分批进行转录组测序分析。其中，单细胞的捕获方式是通过有限稀释法将单细胞悬浮液随机分布在＞200,000个微孔中得以实现的。后续，研究人员根据BD Rhapsody single-cell whole-transcriptome amplification workflow制备全转录组文库，并利用BD Rhapsody analysis pipeline处理分析数据。通过t分布随机邻域嵌入（tSNE）方法，从hCS或hSS中分离出的细胞聚类显示了两种条件下的分离状况。组装后的细胞经过电生理测试表明，GABA能和谷氨酸能神经元能够成功形成电路并相互发送信号。这一成果无疑为研究神经发育和疾病以及神经环路等提供了一个有用的模型。

No.2

为了验证体外诱导分化特异器官上的可靠性，美国斯坦福大学的研究人员于体外培养并诱导12种人类多能干细胞系（human induced pluripotent stem cells lines，hiPSC lines）分化形成hCSs，并利用BD Rhapsody对分化产物进行单细胞转录组分析，以证实该过程的可重复性：在分化的第105天，研究人员将三个平行分化为hCS-FF（Feeder-Free condition，无滋养层细胞条件）的hiPSC lines酶解为单个细胞并进行捕获。再通过对BD Rhapsody磁珠进行二次采样，从约67%的捕获细胞中制备全转录组文库，然后进行后续的cDNA合成等操作，并利用BD Rhapsody analysis pipeline处理测序数据，确定细胞标记和分子指数。最后，使用BD Data View 对单细胞转录组谱进行分析，并将当前数据结果与之前于同一平台上获取的hCS-MEF（Mouse Embryonic Fibroblasts，小鼠胚胎成纤维细胞）和hSS单细胞数据进行比较（n=24,237）。tSNE聚类分析发现，来自hCS和hSS的细胞群聚类揭示了背侧和腹侧分化状态的不同。该研究表明，体外培养神经干细胞的实验方案在不同实验条件、不同干细胞系之间具有良好的重复性，而细胞转录组的差异主要来源于分化时期，并非细胞种系或实验条件。

No.3

成纤维细胞生长因子21（Fibroblast growth factor 21 ，FGF21）是一种肝脏源激素，可向下丘脑腹内侧（ventromedial hypothalamus，VMH）的谷氨酸能神经元发出信号，以抑制碳水化合物的摄入。在此项试验中，来自爱荷华大学医学院和丹麦哥本哈根大学的研究团队充分利用了BD Rhapsody单细胞测序平台，以合理评估哪些细胞能够在下丘脑中表达FGF21的辅助受体KIb（β-klotho）：首先通过BD FACS AriaII对小鼠下丘脑中的目标单细胞进行筛选，然后将筛选出的细胞加载到BD Rhapsody上捕获单个细胞，并进行cDNA的合成。后续，使用两个定制引物panel生成cDNA文库，该panel由BD设计，分别包含低丰度表达基因和高丰度表达基因。通过该方法以及BD Resolve analysis pipeline，研究人员对活细胞进行了有效的细胞排序、质量过滤和测序数据注释，最终获得了1,904个分类后推定的Klb细胞。随后，运用tSNE分析和无监督聚类，确定了12个神经元和非神经元细胞类型的聚类。通过这一途径，研究人员得以精确识别下丘脑中的FGF21靶细胞，并揭示了激活谷氨酸能神经元的FGF21信号是介导FGF21诱导的糖抑制和甜味偏好的必要和充分条件。

No.4

天津医科大学、天津市神经病学研究所刘强教授课题组在此前的文献中报道了脑出血（Perihematomal edema，PHE）后血肿周围脑水肿（intracerebral hemorrhage，ICH）形成的免疫机制。实验过程中，其使用BD Rhapsody捕获单细胞，并通过BD Rhapsody WTA Amplification Kit构建单细胞RNA-seq文库，采用BD Rhapsody数据分析流程处理测序数据，并利用BD Data View对单细胞转录组谱进行分析，绘制了血液对照组（sham blood）、脑水肿出血组（ICH blood）和脑水肿脑样本（ICH brain sample）中12,443个、8,751个和4,270个自然杀伤（natural killer，NK）细胞的基因表达谱。其中，NK细胞从naive C57BL/6小鼠（BD Bioscience）的脾细胞中分离，经纯化后在FACS Aria III系统上进行两轮细胞分选。单细胞测序和免疫学研究表明，NK细胞是ICH早期阶段的主要免疫细胞亚群，单细胞转录谱的无偏聚类显示，脑出血后，两个主要的NK细胞亚群分别具有高的细胞毒性或强烈的趋化因子产生特征，与周围的NK细胞相区别。

“

BD Rhapsody单细胞测序技术正在脑科学领域中发挥着其不可替代的作用。借助于这一工具，许多在形态发生上和功能上不同的脑细胞类型被识别出来，这也让我们对大脑中细胞种类的多样性、细胞的特殊功能或状态等有了更为深入的认知。

BD Rhapsody™单细胞多组学分析系统主要亮点：

高样本兼容性：

基于微孔（Microwell-based）的强大技术和碧迪医疗成熟的流式分选手段，让单细胞实验不再受样本类型的限制；

多组学：

少有的可同时做转录组，免疫组和蛋白组的单细胞分析平台；

高效率低成本：

高效的细胞捕获率，支持1-12个样本同步上样、同步建库，有效减少批间差；

高质量：

Scanner可视化质控系统，确保实验质量，减少实验损失；

高品质服务平台：

提供系列定制化生信分析方案、配套的生信软件及专业的生信支持团队，生信小白也可轻松上手。

Reference：

1. Birey, F. et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature 545, 54–59 (2017).

https://doi.org/10.1038/nature22330

2. Yoon, S.-J. et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods 16, 75–78 (2019).

https://doi.org/10.1038/s41592-018-0255-0

3. Jensen-Cody, S. O. et al. FGF21 Signals to Glutamatergic Neurons in the Ventromedial Hypothalamus to Suppress Carbohydrate Intake. Cell Metabolism 32, 273-286.e6 (2020).

https://doi.org/10.1016/j.cmet.2020.06.008

4. Li, Z. et al. Brain transforms natural killer cells that exacerbate brain edema after intracerebral hemorrhage. Journal of Experimental Medicine 217, e20200213 (2020).

https://doi.org/10.1084/jem.20200213

吉凯基因凭借多年在靶标筛选及验证服务领域的技术积累，建立的标准化、工程化、系统化的GRP平台，为中国研究型医生提供科研服务，加快科研成果转化。其中，多组学平台包含高通量测序平台和蛋白质组学平台：

·高通量测序平台分为常规测序服务和单细胞测序服务：单细胞测序拥有10x和BD两个平台，提供单细胞RNA-seq、单细胞核测序、单细胞混样RNA-seq、单细胞TCR/BCR、单细胞（RNA+ATAC）、空间转录组测序等服务；常规测序服务提供meRIP-seq（m6A/m1A/m7G/m5C 等RNA甲基化修饰测序）、acRIP-seq（ac4C RNA乙酰化修饰测序）、ATAC-seq、Ribo-seq（翻译组测序）、mRNA/miRNA/LncRNA/circRNA-seq、全转录组测序（两文库/三文库）、外泌体miRNA/LncRNA-seq、WGS/WES、WGBS、RRBS、BSAS等服务；

·蛋白质组学平台拥有多台timsTOF Pro、Exploris 480高精度质谱仪，专业领先的Spectronaut Plusar、Mascot等分析软件，提供专业的4D、DIA、TMT、PRM、磷酸化修饰组、olink蛋白质组等检测服务，强大的机器学习算法、IPA分析、蛋白基因组分析服务，系统的生物标志物、分子分型、药物靶点、基因功能研究等解决方案，真正让广大研究型医生的科研工作更省心、更省力、更高效。