文章来源：RNAScript 公众号
众所周知，mRNA技术作为全新的疫苗技术手段，相对于传统疫苗技术而言，具有安全、有效、生产工艺相对简单且无关序列、研发周期短等优势，然而，到目前为止，市面上的mRNA疫苗普遍需要在超低温下储存（辉瑞/BioNTech的BNT162b2需要在−80 °C ~−60 °C下储运；Moderna的mRNA-1273 需要在−20 °C储运），使得其储存和分配运输相对于其他疫苗技术更复杂，成本更高，最终导致中低收入国家的可及性降低。
冻干技术在低温真空下通过升华去除水分，可相对温和地将脆弱的生物大分子或胶体纳米颗粒制备成冻干制剂，已有研究显示该技术可满足mRNA-LNP在室温下的长期储存需求，并能维持复溶后的转染效力（瑞科吉生物早前就已发布全球首款冻干型mRNA疫苗的人体实验数据，证实了冻干mRNA疫苗复溶后可维持转染效力）。
近日，来自比利时根特大学药学院的研究团队在Journal of Controlled Release上发表了题为“Continuous freeze-drying of messenger RNA lipid nanoparticles enables storage at higher temperatures（mRNA脂质纳米颗粒经连续冷冻干燥可在较高温度下储存）”的文章。该文章应用了一种名为“基于旋转冷冻的连续冻干技术”（Continuous freeze-drying based on spin-freezing）的方式，使得冷冻与干燥得过程效率更高，并通过一系列设备实现了整个工艺流程的质量监控。在此基础上，该团队进一步筛选了不同缓冲液类型和脂质配比，并评估这两项工艺参数对冻干生产过程中制剂的理化特性（尺寸、电位、分散系数以及形态）、不同温度下的存储稳定性，以及复溶后转染效力的影响。
“旋冻干”工艺设备
目前主流的冻干工艺主要依靠传统“分批”冻干法，其采用的设备特性决定了其冻干制剂通常需要不短的制备时间（~7天），限制了制剂的高效快速生产，同时也无法做到对产品质量的精确控制。在传统冻干设备中，需要将装有水性制剂的小瓶平放于类似“烤盘”的板块上，并依次将多个板块置入分层式的热控架中。在整个制备过程中，往往因为分层与小瓶位置的不同，使得设备内的水分升华受限，热传导不均匀。由此造成残留水分与成核时间的不同，并导致了同批次产品质量属性不一致的问题。
与传统冻干设备不同，本研究中所用的“旋冻干”技术，其选用的设备为“单瓶连续冷冻干燥系统”（The Single Vial Continuous Freeze-Drying System，SVU，RheaVita）。该系统可模拟连续生产线的加工条件，在短时间内快速评估和筛选不同配方和工艺变量。
进行冷冻干燥时，使用适配旋转搅拌器的I型玻璃小瓶（2ml，德国米尔海姆肖特）填充400μl保护剂溶液和400μl含有12.5μg mRNA的mRNA-LNP悬浮液。将小瓶插入WB6000-D顶置搅拌器（Wiggens，北京，中国），这一设备避免了分层不同空间位置放置造成的成核时间不同与水分升华的效率。随后在该设备中沿各制剂瓶的纵轴以4000rpm的速度旋转，从而在小瓶内壁上铺开薄的液体层，使制剂的升华表面积大幅增加，提高升华速度。然后将旋转的小瓶同时暴露在压缩空气中，压缩空气使用液氮热交换器冷却至约-60°C的温度。使用Bronkhorst F-202AV质量流量控制器（Flowcor，Olen，比利时）控制气体流量，并将其设置为18 l / min或80 l / min的恒定速率，分别提供慢速或快速冷冻速率。通过设备实现了各小瓶相同的工艺条件，这是传统分批冻干所做不到的。研究还使用FLIR A655sc热像仪（Thermal Focus, Ravels，比利时）测量每个制剂瓶温度，将样品瓶冷冻并冷却至−50°C的最终温度。与传统分层“烤盘”式的制备工程相比，实现了对每个产品单位的质量把控。
之后将小瓶半塞并在真空下使用热传导干燥。干燥后，将小瓶用氮气回填至大气压，并加盖回收。通过设备特性在同一设备中保证了整个制备过程中一致的工艺条件，并也实现了同一设备中“连续“冷冻、干燥的制备流程。
图1：“旋冻干”设备SVU的原理示意
脂质比例与缓冲剂品类对冻干后特性的影响
本研究中主要评估的变量为可电离脂质与 mRNA 的比例（wt比）以及缓冲剂品类和相应剂量。该团队将等体积的mRNA LNP和保护剂（25 m/V%蔗糖或海藻糖（Merck）溶解在pH 7.4的Tris-，磷酸盐或PBS缓冲液中）混合以产生终浓度为15.6μg/ ml mRNA和12.5 m/V%冻干保护剂的LNP悬浮液。LNP使用了可电离脂质C12-200，辅助脂质DSPC，胆固醇和DMG-PEG 2000的组分构成，并采用了50：10：38.5：1.5 mol%的摩尔比。
图2：冻干过程与实验设置图解
为初步研究评估LNP中脂质含量在多大程度上有助于冷冻干燥过程中mRNA LNP制剂的稳定性，研究分别设置了C12-200:mRNA wt比为10：1和20：1两组。同时，对市售mRNA疫苗制剂中使用的缓冲液（pH值为7.4的PBS、Tris及磷酸盐）补充12.5 m/V%蔗糖作为冻干保护剂，分别在高和低缓冲液容量下进行了评估。经过冻干复溶后，研究者测量了粒径大小（平均值）、PdI（聚合物分散性指数）、zeta电位和 mRNA 包封效率来评估冻干mRNA-LNP的特性。
结果表明，对于所有制剂，冻干后粒径和PdI没有明显增加（图3A和B）。然而，研究观察到在以C12-200：mRNA wt比为10：1配制的mRNA-LNP冻干后，包封率和包封在LNP中的mRNA数量急剧下降。这在PBS中透析的mRNA-LNP最为明显，包封率从85%降低到仅58%（图3C）。此外，mRNA LNP的zeta电位明显下降（图3E）。然而，在C12-200：mRNA wt比为20：1时，冻干mRNA LNP的包封率仅在使用PBS时降低（92%降至72%），而分散在磷酸盐和Tris缓冲液中的mRNA LNP的性质在冻干时没有改变（图3D&F）。
需要注意，不同缓冲液容量评估结果显示，增加缓冲液容量不能明确防止包封的mRNA泄漏和zeta电位的下降。
图3：不同wt比mRNA-LNP在不同容量缓冲液中冻干前后的特征
研究者接下来比较了HEK293T细胞中冻干制剂与非冻干制剂的转染效率（图2G&H）。在Tris和磷酸盐缓冲液中，无论缓冲液容量如何，mRNA LNP都能在高C12-200：mRNA wt比下保持其转染效率。mRNA LNP分散在PBS中时正如mRNA包封率下降那样，转染效率也急剧下降（±30%）。在低C12-200：mRNA比值下，我们观察到冻干mRNA LNP在两种容量的PBS下转染效率均显著降低，而在高容量和低容量的磷酸盐和Tris缓冲液下的转染效率只是略微降低。
当C12-200：mRNA wt比从10增加到20，PBS被Tris或磷酸盐缓冲液取代时，C12-200 mRNA LNP可以在含有12.5 m/V%蔗糖的配方中更好地完成冻干。
此外，研究还评估了其他工艺条件变化是否可以改善悬浮在Tris 12 mM中的C200-10：mRNA wt比为20：1的LNP冻干的结果。为此，研究者调整了冷冻速率（慢速和快速）和冻干保护剂（12.5m/V%蔗糖和海藻糖）。可以观察到，快速冷冻相比慢速，其升华速率更胜一筹。另一方面，尽管将海藻糖用作冻干保护剂可以略微改善冷冻干燥过程，但无法完全防止冻干对转染效率、包封效率和zeta电位的负面影响（图4）。
图4：评估冻干保护剂和冷冻速率优化的影响
mRNA LNP 冻干前后的形态变化
该团队进一步研究了mRNA LNP在冻干前后的形态变化，使用了冷冻电子显微镜（cryo-EM）以鉴定冷冻干燥前后mRNA LNP的形态（图5）。
冷冻电镜揭示了透析缓冲液和冷冻干燥过的程都会影响mRNA LNP的形态。在Tris中透析的mRNA LNP由固体无定形核心组成，一些悬浮在Tris中的LNP在冻干时形成囊泡，很可能源自于物理应力诱导的分离。PBS透析导致mRNA LNP表现出异质形态，形成内含有mRNA或空的水性囊泡。同时，悬浮在PBS中的mRNA LNP冻干后产生了多层结构，这些结构在水性LNP中大多不存在，可能会引起相关安全性的考量。
图5：冷冻电镜下mRNA LNP在不同缓冲剂中的形态
Tris 缓冲液可增强mRNA LNP冻干制剂在较高温度下的稳定性
尽管优化后的mRNA LNPs在4°C下可稳定保存12周，但这仍然需要冷链物流。出于这个原因，该团队还研究了冻干mRNA LNP是否可以提高在室温（室温，22°C）或更高温度（37°C）下储存的稳定性。
对于在室温（RT，22°C）下储存的水性mRNA LNP，观察到转染细胞数量和MFI急剧减少（分别减少30%和40%）（图5A和B）。相比之下，冻干制剂在22°C甚至37°C下储存12周后不会失去转染效率，表明冻干具有明显的优势。
然而，我们注意到在37°C下储存冻干的mRNA LNP时，粒径从80纳米增加到150纳米（图5E和F）。此外，我们还观察到在22°C和37°C下储存均会略微降低mRNA LNP在水和冻干条件下的包封率（图5C&D）。然而，应该注意的是，对于冻干和水性mRNA LNPs，包封率均稳定维持了8周。
图6：编码eGFPs的mRNA LNP冻干制剂稳定性
为验证小鼠肌内注射给药冻干mRNA LNP的转染效率，研究者将C12-200：mRNA比值为20的编码fLuc的mRNA LNP悬浮在含有12.5m/V%蔗糖的Tris 20mM中，随后冻干并以3μgfLuc mRNA的剂量给予小鼠。作为阳性对照，施用相同体积剂量的新鲜制备的fLuc mRNA LNP。注射后5小时，通过生物发光成像测量体内蛋白质表达。fLuc mRNA LNPs冻干前后的体外转染效率相似，并在小鼠模型中观测到相似的mRNA表达效率，表明冻干可以应用于包封各种类型mRNA的LNP（图7）。
图7：冻干mRNA LNP在小鼠体内的转染效率
总结
研究提出了一种使用基于旋转冷冻的连续冷冻干燥技术来冻干基于可电离脂质类 C12-200 的 mRNA LNP 的方法。研究者发现，当可电离脂质：mRNA wt比足够高并且使用Tris或磷酸盐而不是PBS作为缓冲液时，mRNA LNP的性质在冷冻干燥后能保持不变。此外，fLuc mRNA LNP冻干制剂的荧光素酶表达在小鼠体内没有改变，证明了mRNA LNP冻干制剂可以增强mRNA疫苗在常温下的稳定性，在4°C、22°C甚至37°C下储存12周时仍保留其功能，是一种有可行性的策略。
然而，我们也能注意到，在37°C下储存的mRNA LNP冻干制剂，其粒径表现出相当大的变化（从80nm增加到150nm），同时异构形态也带来了对转染有效性和安全性的疑虑。尽管在小鼠模型中依旧观察到了稳定维持的转染效率，然而粒径过大与异构形态对于mRNA LNP在大型动物及人类体内的转染依旧存在影响。我们之前在“LNP最新优化方案，克服动物模型研究局限性！”一文中探讨了粒径变化在不同物种中转染效率的影响。有研究显示，粒径过大将导致mRNA LNP无法穿过NHP及人类肝窗并转染肝脏细胞。因此该成果的临床有效性与安全性仍需进行进一步的NHP模型验证，以复现较高温储存的冻干制剂与水性mRNA LNP相似的转染效率和安全性。
另一个不可忽视的问题在于生产放大的可行性。该技术与传统冻干工艺最大的不同在于对每个单位产品工艺的把控，虽然实现了稳定的产品质量控制与检验，但不能忽视由此带来的每批次产品产量产能的减少，设备的特性决定了“旋冻干”制备每批次产量无法与传统工艺媲美。然而单位时间内的整体产能我们并没有在该文中得到相应的对照，因此是否能将该工艺应用到大规模生产中仍然存疑。
参考资料
Meulewaeter S, Nuytten G, Cheng MHY, De Smedt SC, Cullis PR, De Beer T, Lentacker I, Verbeke R. Continuous freeze-drying of messenger RNA lipid nanoparticles enables storage at higher temperatures. J Control Release. 2023 Mar 30;357:149-160. doi: 10.1016/j.jconrel.2023.03.039.
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