背景介绍
SAC-101为天然提取物，需开发纯度方法进行质量控制。因天然提取产物中杂质含量较多，且批间差异较大，纯度方法开发难度大。故在方法开发中多次采用ACD Labs软件辅助进行方法开发。
梯度实验设计的应用
在方法开发过程中遇到关注杂质之间无法分离，且多次优化流动相pH和梯度均无法达到分离，故设计梯度实验设计，查看梯度条件是否对分离具有选择性。
01
梯度实验设计
02
采集数据分析
03
构建数学模型和知识点
经过大量模拟和条件选择，证明在该色谱柱和流动相下，存在关注杂质无法实现分离，下一步应更换其他条件参数，如色谱柱和有机相种类。
色谱柱筛选
色谱柱对比：选择中谱红PR-C18（4.6*150mm，3μm）、菲罗门Titank C18（4.6*100mm，3μm）、岛津HD-C18（4.6*250mm，5μm）、中谱红ODS（4.6*150mm，3μm）进行对比。
对比上图，中谱红ODS色谱柱对关注杂质分离较好。
有机相种类对比
甲醇对未知杂质的分离选择性较好。
中谱红ODS色谱柱分离较好、主峰前杂质在乙腈中分离较好，主峰后杂质在甲醇中分离较好，故设计有机相种类和梯度程序两因素实验。
梯度及有机相种类两因素实验设计
通过色谱柱筛选、流动相pH对比、梯度调整、有机相比例调整，发现对于SAC-102方法的开发，色谱柱较为局限，中谱红ODS-H柱选择性较好，流动相pH会影响部分杂质峰形，对比酸性、中性、碱性流动相，流动相pH固定为pH2.3磷酸盐缓冲液较好。梯度程序和有机相种类对关注杂质的分离存在显著影响，故进行梯度程序和有机相种类两因素实验辅助开发。
有机相种类的选择和决策：尝试甲醇、乙腈、四氢呋喃，四氢呋喃会导致杂质峰个数较少，故选择甲醇、乙腈进行因素考察。并根据洗脱差异和选择性，分别设置甲醇：乙腈=1:1、甲醇：乙腈=7:3、甲醇：乙腈=1:4进行对比
梯度程序的选择和决策：SAG-102中考察杂质众多，改变梯度变化的速率进行建模，分别选择40、50、60分钟的梯度变化。
01
实验设计
设计流动相pH及梯度程序的两因素实验，共9个实验，设计见下。
02
两因素数据人工分析
梯度的影响：同一流动相体系下，有机相选择甲-乙腈=70:30，不同梯度程序，各组分均为规则样品，出峰顺序一致，但分离情况基本一致，显示梯度能够改变k但对选择性α的贡献小。
有机相种类的影响：同一梯度程序，不同有机相比例，部分组分k和出峰顺序发上较大变化，如主峰附近等，有机相种类对保留因子k和选择性α存在贡献。
03
构建模型
根据上述条件所采集的数据于ACD/AutoChrom 上进行建模，将以上条件下的进样结果数据导入ACD建模，经过多次尝试，发现采用单独的有机相比例即纯甲醇/纯乙腈作为流动相B，SAC-102中各杂质均无法分离，其中甲醇在前30min分离较好；乙腈在30min后保留较强的杂质中，利用其较好的洗脱能力能够得到很好的分离。因此计划采用两个有机相段，梯度前段使用高甲醇比例保证关注杂质的分离，梯度后段使用高乙腈，加速高疏水杂质的洗脱与分离。
下图为有机相甲醇比例较高时前30min分离较好：
下图为有机相比例中乙腈比例较高时色谱图后段分离较好：
参考上述ACD辅助建模结果，并将有机相比例进行换算，待尝试的方法条件为：
04
模型方法重现确认
设置方法参数进行重现：
尝试方法重现图
采用模型优化方法，主要关注杂质均能与相邻杂质得到基线分离，ACD模型提供了耐用性和分离较好的条件，仅主峰与相邻小杂质峰未分离，考虑到天然产物批间差异较大，其他批主峰相邻处杂质未必检出，故先用该方法进行检测。
随着研究的进行，后期样品厂家和批号发生变化，导致杂质谱发生显著变化，前期方法不适用。新增的杂质峰形较差。
梯度实验设计的应用
SAC-102样品发生变化。导致杂质谱发生变化，故需对方法重新进行评估，因为更改后样品杂质个数减小，故根据前期结果可回到单有机相种类（甲醇）进行开发，采用单梯度进行，并优化了新增杂质的峰形。最后采用优化中已尝试的4个梯度程序进行梯度建模辅助开发。
梯度建模图
方法重现图
方法条件重现了预测图谱，且筛选的方法条件耐用性较好，进行流动相比例、流速、pH等耐用性实验和不同仪器的重现性试验，方法均符合分离要求，有较好的耐用范围。
总结分析
天然产物提取物，因杂质较多，批间差异大，存在多个同分异构体，方法开发难度大，耗时久。在整个开发过程中，遇到的典型问题是：
（1）两个组分之间无法完全分离，更换多个条件均无法分离，甚至在分离度0.9的基础上，尝试多个条件优化，耗费大量时间，均无法实现完全分离；
（2）存在杂质较多，前后不同出峰时间段的杂质分离无法兼顾情况；
（3）也包括采用一批样品实现了分离，但更换厂家和批号后，杂质谱发生变化，各组分又存在分离问题，需再次进行开发。真是由衷感叹，天然产物的分离真是让人左右为难。
但在方法开发中多次使用ACD进行不同的因素实验设计，让我们对方法的各个因素有了直观的了解，并且用少量的实验构建模型，快速的评估了考察因素是否有选择性，是否可以通过改变该因素达到目标分离，可分离同时有一定耐用性的条件是什么？大量节省了我们方法优化的时间，也增强了我们对方法的了解。
甚至我们在开发过程中也在不断的回顾，杂质谱发生变化后，回顾了前期进行的ACD实验结果，ACD软件构建的知识空间提供了很大帮助，在了解那些因素对组分存在选择性的基础下，前期存在分离的条件我们也可进行选择。更好的让所有有效开发实验存储起来，反复的应用。也因为ACD软件的结果可视化，开发中不断地参考ACD软件结果，避免了很多无效的尝试。
在上半年听了ACD线上AQbD系列的培训，了解到ACD软件还可以提供PB实验设计的功能，采用少量实验快速的在众多因素中筛选出显著因素，再进行详细的实验设计，筛选出符合要求的实验条件，我想应该比我们这次的开发要更简单和科学，很期待下次的使用。
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