抗体的应用非常广泛,制备特异性抗体可用于检测、分析多种分子和细胞,为生物学研究提供有利支持。
传统抗体生产通常是通过免疫动物免疫以及后续的细胞融合、筛选等步骤来获得。这个过程需要几周甚至几个月的时间,实验成本较高(包括免疫动物的购买和饲养、免疫原的制备和购买等)。
与传统方法相比,无细胞蛋白表达技术是一种细胞外的基因表达技术,通过含有蛋白合成所需各主要组分(如氨基酸、酶、各种因子等)的表达系统,不受细胞核(核酸DNA/RNA)、线粒体、细胞骨架等的干扰,在体外快速、大量表达蛋白,同时避免了复杂的细胞培养和纯化步骤。
Cell-Free System(CFS)
无细胞蛋白表达系统
CFS利用麦胚提取物,人工提供蛋白表达所需的酶、辅助因子,并模拟表达环境,仅使用PCR片段或载体为模板,即可在反应体系中通过双层液相反应法 (Bilayer Reaction Method) 进行蛋白表达。表达成功率高达95%,总蛋白产量高达4 mg/6 mL,绝大多数表达出的蛋白具有天然的结构和活性。
CFS操作简单,只需四步,构建好模板DNA后,两天即可获得目的蛋白。
与传统细胞内表达系统的区别
● 无需诱导培养,大大简化了操作步骤以及下游实验流程,能够用于高通量实验;
● 体外表达取消了生理限制,显著提高具有功能性、可溶性、全长蛋白的总体产量;
● 可实现磷酸化修饰,并不受蛋白毒性影响,十分适合激酶、膜蛋白等毒性蛋白的表达;
● 并可通过修饰的tRNA,在特定位点插入非天然氨基酸标记。
抗体Fab片段高稳定性表达系统
在制备抗体的过程中,研究抗体的Fab片段可以为制备抗体提供重要的指导和参考。无细胞蛋白表达技术在制备抗体Fab片段方面有许多优点。这项技术不仅能够提高抗体纯度,还能避免传统制备方法中细胞培养污染和稳定性差等问题,从而缩短制备时间,有效降低成本。
IgG(兔)Rab 片段结构和二硫键位置
蛋白表达后功能验证
在四种不同的条件下(1: Empty, 2: + PDI and Ero1α, 3: + CypB, 4: + PDI, Ero1, and CypB)合成蛋白,通过Pull-down实验验证AGIA序列与每个Fab片段的结合亲和力。Western blotting结果验证,由PDI和Ero1α合成的Fab片段(GST-AGIA第2和第4道)确实与AGIA序列结合。
无细胞蛋白表达系统的广泛应用
CFS无细胞蛋白表达技术不仅能够用于抗体制备,还可用于重组蛋白及复杂蛋白的生产,如重组人胰岛素、酶、激素等。这些蛋白质的生产通常需要复杂的细胞培养体系,但在无细胞蛋白表达技术的帮助下,生产过程变得更加高效、简单。
在药物筛选领域,无细胞蛋白表达技术可用于多种蛋白的快速表达及筛选体系建立。帮助药物研发人员更快找到适合的药物,缩短药物研发时间和成本。
无细胞蛋白表达技术的出现,为蛋白功能的研究和药物研发带来了新的思路和方法。
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参考文献:
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