小环状干扰RNA(sciRNAs)作为基因沉默的有效治疗平台

摘要

为了实现由RNA干扰(RNAi)途径介导的有效的治疗性转录后基因沉默，必须对小干扰RNA(siRNA)进行化学修饰。几种具有稳定siRNA代谢潜力的超RNA结构已被评估其诱导基因沉默的能力，但它们都有局限性或尚未在治疗相关背景下进行探索。共价闭合环状RNA转录物在真核生物中普遍存在，具有作为生物标志物和疾病靶点的潜力，环状RNA模拟物正在被探索用于治疗。在这里，我们报道了小环状干扰RNA(sciRNAs)的合成和评价。为了合成sciRNA，用三价N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)配体功能化并使用“click”化学环化的正义链被退火成反义链。这种策略用于合成小圆环，但也可用于合成较大的环状RNA模拟物。我们在体外和体内评估了各种sciRNA设计。我们观察到循环后正义链的代谢稳定性得到改善，脱靶效应被消除。反义链的5''-(E)-乙烯基膦酸盐修饰导致GalNAc-sciRNA在体内的治疗相关剂量有效。物理化学研究和基于核磁共振的结构分析，以及分子模型研究，揭示了这类具有部分双链特征的新型siRNA与RNAi机制的相互作用。

图1 (A) sciRNA中使用的化学修饰。(B) GalNAc -偶联sciRNA示意图。

图2 sciRNA-GalNAc偶联物点击环正义链的合成。简称:Q, 6-叠氮己基柄; Y: 炔羟基脯氨酸磷酰胺; L, GalNAc配体; Z, 连接子。

表1 线性GalNAc-siRNA和环状GalNAc-siRNA的序列、热稳定性和体外效力。

正义链序列是最上面的行;反义链序列为底行。Z表示环状寡核苷酸。化学修饰如下：•，PS键; 小写的核苷酸，2''-OMe; 大写的核苷酸用斜体表示，2''-F; Q,6-azidohexyl-phosphate; 副VP,5''-(E)-vinylphosphonate。

用10倍辅助因子溶液稀释大鼠血浆(BioIVT,Cat# RAT00PL38NCXNN)和肝脏匀浆(BioIVT，定制订单)，最终浓度为1mM MgCl2, 1mM MnCl2和2mM CaCl2。将sciRNA加入到50μl的血浆或肝脏匀浆中，最终浓度为20μg/ml。反应混合物在37℃下轻摇孵育。在每个预定时间点(0,1,4,8和24h)，加入450μL含有内标(寡核苷酸U21，终浓度为1μg/ml)的Clarity OTX裂解上样缓冲液(Phenomenex,Cat# AL0-8579)停止反应，并在-80°C冷冻至分析。实验一式三次。

使用Liu等人(49)描述的Clarity OTX 96孔固相萃取板进行LC-MS分析的寡核苷酸富集。固相萃取柱初始用1 ml甲醇，然后用2ml 50mM醋酸铵和2mM叠氮化钠在HPLC级水中平衡。样品通过正压加载到固相萃取柱上。然后用1ml 50mM乙酸铵在50/50(v/v)水和乙腈(pH5.5)中洗涤5次。最后，用含有10mM EDTA, 100mM碳酸氢铵的洗脱缓冲液在40/10/50(v/v/v)乙腈/四氢呋喃/水(pH8.8)中洗脱寡核苷酸。洗脱液在氮气下干燥，重悬于120μl LC-MS级水中进行LC-MS分析。

大鼠血浆和肝脏匀浆已被用于表征GalNAc偶联寡核苷酸的代谢。在长达8小时的血浆中检测到环状或线性siRNA链均未降解(图4A)。然而，在我们的LC-MS代谢物分析中，我们观察到在大鼠血浆中孵育24小时后，环状链上增加了一个水分子。从大鼠肝脏匀浆或血浆中鉴定si-4的代谢物见补充表S4，从大鼠肝脏匀浆或血浆中鉴定si-5的代谢物见补充表S5。我们的理论认为，这种物种是由于开放的环状结构产生线性化的寡核苷酸。在大鼠肝脏匀浆中，环形sciRNA(si-4和si-5)比线性sciRNA(si-3)更稳定。在24h时si-4或si-5没有降解，而对于si-3，在24h时仅检测到全长正义链的约55%(图4B)。与具有4小时半衰期的线性siRNA相比，sciRNA的半衰期明显更长，为29和30小时。这与单链稳定性分析的结果有关，其中环化增强了外切酶存在下的稳定性。在肝脏匀浆中，我们没有观察到si-4或si-5的正义链的环状结构打开。

图4 线性GalNAc-siRNA si-3和GalNAc-sciRNAs与环状正义链si-4和si-5在血浆和肝脏匀浆中孵育后全长正义链的稳定性使用LC-MS测量。(A)大鼠血浆或(B)大鼠肝脏匀浆中剩余全长正义链百分比(log10)。用误差条表示每个时间点三个重复的标准差。