实验材料 质粒DNA

试剂、试剂盒 dNTPDNA聚合酶Klenow酶TETAE溴化乙锭TEMED过硫酸铵BSA

仪器、耗材 培养箱离心管

实验步骤

1.  用一种或多种限制性内切酶在100 μl 体积中消化10 μg 质粒人，产生25~100 bp  的含有结合位点的DNA片段，并至少有一端是5’突出的。

2.  加100 μCi［α-32P］dNTP，4μl 5 mmol/l 3种NTP的混合液，2.5U Klenow酶。室温温育20 min。

3.  加4 μl 含有5 mmol/l 与被标记的相同的dNTP溶液，室温温育5 min。

4.  沉淀DNA，溶解于TE中。

5.  加10×加样缓冲液，用2%小型琼脂凝胶（含溴化乙锭5 μg/ml）在TAE或TBE缓冲液中进行电泳。

6.  在长波透射紫外灯下观察电泳带。在带的下游切一平行缝隙，插入一片DEAE膜（先在凝胶缓冲液中浸湿）。将膜紧挤于胶中，继续电泳直到泳动至膜上。

7.  将膜在电泳缓冲液中洗一下，在滤纸上吸干。将膜放入1.5 ml 螺口盖的圆底管底部，其中装有400 μl DEAE洗脱液，68℃水浴30 min。

8.  将洗脱液移入1.5 ml 的离心管中，4℃微量离心15 min。将上清转入干净管中，留10 μl 于原管管底。

9.  在上清中加入4 μl 1 mol/l MgCl2。用1 ml 100%乙醇沉淀DNA，重悬于100 μl TE缓冲液中。

10.  取1 μl 测定cpm/μl min，用溴化乙锭打点法定量估计DNA浓度。

11.  安装16 cm 长的电泳玻璃板和1. 5 mm 厚的垫片。在40 ml 低离子強度凝胶混合液中加100 μl 30%的过硫酸铵及34 μl TDMED，灌入玻璃板之间，插入齿宽≥7 mm 的梳子。让胶聚合20 min。

12.  将梳子和底边的垫片取出。将胶放入盛有低离子强度电泳缓冲液的电泳漕中，用双头泵以5~30 ml/min 循环电泳缓冲液。100 V（约22mA）预电泳90 min以上， 

13.  在微量离心管中，加终体积15 μl 的下列成分：10 000 c/min 的DNA探针，终浓度300 μg/ml BSA，及取自缓冲液中的粗制蛋白提取物中的大约15 μg 蛋白质。混匀，置30℃水浴15 min。

14.  在1个加样孔加入少量10×加样缓冲液并让染料跑进胶。在其他孔中加各结合反应液，在约30~35mA下电泳，直至溴酚蓝（相当于约70 bp 的条带）达到胶底。

15.  卸下凝胶电泳装置，撬开电泳玻璃板，将粘附了凝胶的玻璃板平放在实验台上，在胶上放置3张Whatman 3MM滤纸。将滤纸连同凝胶一起揭下。

16.  用塑料薄膜包裹凝胶进行真空干燥。在不使用增感屏的条件下，凝胶膜放射自显影过夜，或用增慼屏放射自显影2~3 h。