常量凯氏定氮法测定食品中蛋白质--方法原理

样品与硫酸和催化剂一同加热后消化,使蛋白质分解,其中的碳和氢分别被氧化成二氧化碳和水蒸气逸出,而有机氮转化成氨后与硫酸结合生成硫酸铵,然后在碱性条件下蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后再用硫酸或盐酸标准溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即得蛋白质含量。以甘氨酸为例,该过程的反应方程式如下:

消化    2NH₂(CH₂)₂COOH+13H₂SO₄→(NH₄)₂SO₄+6CO₂+12SO₂↑+16H₂O

蒸馏    (NH4)₂SO₄+2NaOH--2H₂O+Na₂SO₄+2NH₃↑

吸收    2NH₃+4H₃BO₃-(NH₄)₂B₄O₇+5H₂O

滴定    (NH4)2B4O7+2HCl+5H₂O  2NH₄CI+4H₃BO₃

在消化过程中,浓硫酸具有脱水性和炭化性,使有机物脱水并炭化为碳、氢、氮。浓硫酸又有氧化性,使炭化后的碳氧化为二氧化碳硫酸则被还原成二氧化硫:

 2H₂SO₄-2SO₂+2H₂O+CO₂↑

二氧化硫使氮还原为氨,本身则被氧化为三氧化硫氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中:

 H₂SO₄+2NH₃-(NH₄)₂SO₄

在消化反应中,为了加速蛋白质的分解,缩短消化时间,常加入下列催化剂。

①硫酸钾    加入硫酸钾的目的是为了提高溶液的沸点,加快有机物的分解。硫酸钾与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度,一般纯硫酸的沸点为340℃左右,而添加硫酸钾后,可使温度提高至400℃以上,而且随着消化过程中硫酸不断地被分解,水分不断逸出而使硫酸氢钾的浓度逐渐增大,故沸点不断升高,其反应式如下:

 K₂SO₄+H₂SO₄--2KHSO₄

 2KHSO₄-K₂S0₄+H₂O↑+SO₃

但是,硫酸钾的加入量也不能太大,否则消化体系温度过高,又会引起已生成的铵盐发生热分解析出氨而造成损失:

(NH₄)₂SO₄→NH₃↑+(NH₄)HSO₄

2(NH₄)HSO₄ 2NH₃↑+2SO₃↑+2H₂O

2CuSO₄ Cu₂SO₄+SO₂↑+O₂↑

除硫酸钾外,也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点,但效果不如硫酸钾。

②硫酸铜    硫酸铜在消化中起催化剂的作用。并且,蓝色的硫酸铜溶液还可指示消化终点的到达,以及下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。

除硫酸铜外,凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多,还有氧化汞、汞、硒粉等,但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素,应用最广泛的是硫酸铜。另外,使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物的氧化分解。