2018-2019 年，国家药典委员会相继公布了 2020 年版《中国药典》四部通则 0512 高效液相色谱法的三次征求意见稿。在征求意见稿中，对于梯度洗脱程序要求保持不同规格色谱柱的洗脱体积倍数相同，从而保证梯度变化相同，并需考虑不同仪器系统体积的差异。
不同仪器之间系统体积是否存在差异？这些差异对实验结果有哪些影响？为何实验方法和条件相同，结果却大相径庭？如果结果不一致，实验方法应当如何调整？这些随之而来的疑问，您都一一理清了吗？
仪器间的系统体积差异
对实验结果有何影响？
在回答此问题之前先明确一个概念，完全相同的方法在不同仪器之间的运行叫方法转移。由于不同厂家以及同一厂家不同型号的仪器在设计生产时的原理和构造不尽相同，因此不同仪器之间的系统体积存在差异。而其中，对实验结果产生影响的体积有延迟体积和扩散体积，这是导致方法转移结果不同的原因之一。
延迟体积又叫滞后体积，是指梯度混合点到色谱柱柱头之间的体积。对于四元泵而言即为泵前比例阀到色谱柱头的体积，二元泵为泵后混合点到色谱柱柱头的体积，因此四元泵比二元泵有更大的延迟体积，见图 1。在运行梯度方法时，延迟体积越大，改变流动相比例到达色谱柱头的时间就越长，在低流速时影响更加显著，因此可能会对分离及保留时间有一定的影响。
图 1 四元系统与二元系统延迟体积示意图
扩散体积又叫死体积，是指连接进样器到检测器之间的所有管线与空腔的体积。这部分体积对于最终结果的影响是，在扩散体积相对较大而流速相对较低的情况下，极易产生色谱峰的展宽、拖尾，因此而产生分离度下降。
所以重点来了，当系统的延迟体积与扩散体积较大时，尽量选择高流速与大内径的色谱柱进行实验，而当使用小流速（通常伴随着使用小内径色谱柱）进行实验时，对仪器的延迟体积与扩散体积应有更高的要求。
方法转移时，延迟体积与混合行为的差异将引起实验结果不一致
混合行为的不同，也可在方法转移时，引起实验结果变化。混合主要是在混合器中进行，其腔体积的大小与混合原理都会影响流动相的混合程度，因此在方法转移时由于延迟体积与混合行为的差异也将引起保留时间与分离度的变化，原理见图 2，结果差异见图 3。
图 2 延迟体积和混合行为对梯度表现的影响
图 3 不同延迟体积及混合行为的液相色谱系统在运行梯度方法时分离结果差异示意图
这就是我们实验人员一直纳闷的“为什么我的方法、色谱柱、流动相完全一样，而仅仅是换了台仪器，实验结果就不一样了”的原因。而伴随着 2020 版药典 UHPLC 方法的引入，您可能在分析时采用更高耐压、更小延迟与扩散体积的仪器，这将会产生与以前常规 HPLC 系统相比差异更大的结果，方法转移难度显著增加。
遇到这种情况，无需慌张，安捷伦科技公司强大的ISET智能系统模拟技术可以协助您轻松解决方法转移难题。
ISET 智能系统模拟技术，
确保方法转移的结果一致
ISET 智能系统模拟技术通过内部模拟转换算法，可以在 Agilent 1290 Infinity II LC 或 1260 Prime LC 上模拟其它仪器系统（要求模拟系统的延迟体积大于 ISET 所在仪器的延迟体积）的延迟体积与混合方式，协助您完成仪器间的方法转移，并最终呈现与原机器相同的结果。如图 4 所示，在 ISET 协助下方法转移时所得结果的对比。
图 4 1260 运行梯度方法、1290 运行梯度方法以及 1290 开启 ISET 模拟1260运行梯度方法分别获得的分离结果
有了 ISET 智能系统模拟技术，“一机多用”不再是梦，既可以在 1290 Infinity II LC 或 1260 Prime LC 上直接开展 UHPLC 方法，提高工作效率；又可以在本套系统上启动 ISET，模拟获得已有的传统 HPLC 结果，实现 HPLC 与 UHPLC 方法的完美转换。此外，对于方法开发人员而言，在 UHPLC 仪器上可直接模拟传统 HPLC 开发分析方法，所获得的方法能直接过渡到常规 HPLC，大大减少了由于方法转移造成的结果差异，显著缩减了繁琐的方法调整过程。
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