春眠不觉晓，WB 知多少（二）

在孵育抗体之前，如何确认转膜效率？

根据检测方法不同：

1.使用 QuickStain 试剂盒的 Cy5 染料预染全蛋白，转印后采用 Typhoon 进行荧光成像检测；

2.使用预染或荧光分子量 Marker 观察；

3.在转膜后，对凝胶染色，或用丽春红对膜进行可逆染色。

封闭试剂就脱脂奶粉或 BSA？

封闭液不是你想用，想用就能用。比如检测磷酸化蛋白，建议使用 BSA 代替脱脂奶粉作为封闭试剂，因为牛奶中含有酪蛋白，因此具有磷酸化表位，同时避免使用含有磷酸盐的缓冲液（如 PBS）。类似地，脱脂奶粉中含有生物素和糖蛋白，当使用 Biotin/Streptavidin 检测系统（生物素化二抗，三级信号放大）或使用 Con A 偶联抗体时，不适合用来封闭。

Cy3 荧光检测时，建议使用 Tween-20，其它去污剂可能会干扰检测，且检测前仍然需要加一次 PBS 清洗步骤。封闭液推荐使用 5% BSA，最好的方法是选择低背景的 Amersham ECL Prime 封闭试剂（货号：RPN418）。

GE 有 CyDye 染料预标记的二抗吗？还是需要购买试剂盒自己偶联？

哥家给客户准备了 CyDye 染料预标记的二抗，包括山羊抗鼠或兔的二抗，分别为 Cy3 或 Cy5 标记。如果仅检测两种目标蛋白，如磷酸化和非磷酸化、一个目的蛋白和一个内参蛋白，则分别选择不同物种来源的一抗即可；如果需要三种荧光信号同时检测，如两种不同修饰状态加一个内参蛋白，则需要购买 Cy2 荧光染料，单独标记第三种抗体。同样的，也可以不使用内参，选择 QuickStain 试剂盒进行总蛋白标记，采用总蛋白归一化方式进行定量分析。

图 5. 三通道荧光检测示意图

另外，哥家也有常规 HRP 标记的二抗，用于 ECL 底物显色，促销货号 NA931-1 ML（Amersham ECL HRP 标记羊抗鼠）和 NA934-1 ML（Amersham ECL HRP 标记驴抗兔）。

如何优化抗体浓度？

常用 Dot blot 斑点杂交。或更可靠的方法是直接电泳转膜后根据泳道切成细长条，可以放在 15 或 50 mL 离心管中孵育抗体从而节省用量。摸索二抗条件时，可以将同种浓度的细长条一起孵育。上述方法还可以用于上样量、封闭剂、一抗种属来源等条件筛选。

图 6. 转膜后将膜切成细长条并在不同抗体浓度中孵育

什么是剥离再杂交，如何操作？

同一张膜在曝光后可以在一定条件下将抗体剥离掉，针对膜上结合的蛋白样品使用新的一抗再杂交，从而检测两种以上不同蛋白。

剥离条件包括：去污剂、还原剂，同时进行加热、酸、碱或高盐等条件处理。全程需避免膜干燥，否则蛋白会牢固结合。具体操作方法请点击「查看原文」，WB Principles and Methods。但是，剥离再杂交，可能会造成蛋白不均匀的剥离，尤其是低丰度蛋白，因此，更加推荐使用荧光标记抗体的方法进行多重检测。

灵敏度和线性到底是什么关系？对选择检测方法有影响吗？

灵敏度 Sensitivity，是指能够检测到的最小的蛋白量，受到抗体量、抗体浓度、检测方法和曝光时间等的影响。

一般用两个指标来衡量：

LOD（Limit of detection），某种检测条件下能够「看到」的蛋白量；

LOQ（Limit of quantitation），可以用于准确定量的信号强度，决定于信噪比，通常高于 LOD。

线性范围 Linear dynamic range，是指信号强度和蛋白量成正比的区间，从而可以用来定量蛋白。

WB 检测方法，主要有显色剂、放射性同位素、化学发光、化学荧光、荧光等。显色剂法灵敏度低、放射性操作存在安全问题，使用渐少。化学发光和荧光，具有高的灵敏度和宽线性范围而成为主流。

化学发光可以使用 X 光胶片或 CCD 成像。X 光胶片，如哥家 Hyperfilm 高感度底片，通常灵敏度高，没有光损失，可以检测到较低浓度的蛋白，但是因为往往需要较多的曝光时间，容易造成高背景，且线性范围窄。CCD 成像，不需要胶片和暗室曝光，具有较高的检测灵敏度，同时具有宽的线性范围，最常用。

新兴且热门的荧光检测可谓中看又中用。荧光检测可以针对分子量相差很小、无法用凝胶分开的蛋白进行同时检测，如蛋白翻译后的磷酸化修饰等；可以将来自不同种属、无交叉反应的2-3种一抗同时与膜孵育（如果一抗需要回收，可以分别孵育），加入二抗后直接成像，CyDye 荧光信号可以保留数月之久；同时检测多个目标蛋白，无需剥离再杂交。但是，一般荧光检测较化学发光的灵敏度稍差，然而，哥家 Typhoon NIR 采用了新一代增强光电倍增管 (PMT) 作为信号检测器，增强了近红外波段的检测灵敏度，PMT 强大的信号放大能力，确保微弱信号可以检测，同时具宽广的线性动态范围。

图 7. X 光胶片和 CCD 成像仪以及 Amersham Typhoon NIR 检测动态范围对比图

WB 化学发光检测过程中，需要对蛋白进行定量，如何选择 ECL 发光液？

Amersham ECL Prime 和 Amersham ECL Select 都可以用于用于定量检测蛋白。ECL Prime（促销货号：RPN2232 或 RPN2236）检测灵敏度在 pg 级别，可以满足大部分实验需要，使用高度稀释后的抗体（一抗 1:1000 - 1:50000；二抗 1:50000 - 1:250000）；信号稳定性强，最长可以持续 24 小时，可以多次曝光或同时处理大批量样品；结合 Hybond PVDF 高蛋白吸附能力的膜一起使用，效果更佳。ECL Select 具有超高灵敏度，可以达到 10^-2 pg 级，即传说中的飞克级别。

如何鉴定 ECL 发光液是否正常工作？ 

在暗室中，准备 1 mL 的 ECL 工作液，加入 1 -3 uL 未稀释的 HRP 标记的二抗并混匀，正常情况下，溶液会出现一道肉眼明显可见的蓝白光。或者，将 2-5 uL 的 1：100 稀释的 HRP 二抗，点到膜上，加入 ECL 工作液，使用 AI680（CCD成像） 或 X 胶片曝光。

还想继续 Liao？

按照下方联系方式

借着 WB 促销的春风

火速找到我们！

产品购买 24 小时快速通道：

gels.yilimart.com