春眠不觉晓，WB 知多少（一）

GE生命科学

2019.4.25

作者思拓凡

TA的动态

WB 答疑

哥家 Western blotting（以下简称 WB）系列产品促销已经在 4 月的春风中拉开帷幕（猛戳链接「G 然相识，E 路相陪，W 大步流星，B 有惊喜」），热线上小伙伴们的咨询热情也是一路飙升。小电泳，大智慧。哥家为您提供 WB 全套解决方案（见图 1）。

WB 的实验流程为：样品制备-凝胶电泳-转印-抗体孵育-检测分析，今天小编特意汇总了在 WB 这 5 个关键步骤中最为常见的 19 个问题，希望小伙伴们能够顺顺利利的做 WB 实验。

图 1. GE 蛋白免疫印迹相关仪器和耗材产品

样品制备

不同类型的样品，均有对应的蛋白提取方法，可以对号入座。哥家为大家准备了各种蛋白酶抑制剂、核酸酶以及样品研磨、多种类型蛋白抽提缓冲液试剂盒、样品脱盐和 Clean-up 试剂盒等。

点击「查看原文」获取

《蛋白电泳免疫印迹产品指南》

图 2. 不同细胞和组织样品提取方法概览

低丰度蛋白是否需要预处理？

低丰度蛋白建议在 WB 分析前使用亲和等方法进行预富集，如可以采用 Mag sephorase TiO₂（500 µL 货号：28944010）对磷酸化蛋白进行免疫沉淀富集；或反过来，去除几种高丰度蛋白，如血浆中的白蛋白和 IgG（离心柱货号：28948020）等，以提高低丰度蛋白含量。

如果珍贵稀少的样品需要同时提取 DNA、RNA 和蛋白，请选择 illustra™ triplePrep™ Kit（50次：

28942544；10次：28945434）。

tripleprep 50

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样品如何脱盐和去除小分子杂质？

可以使用脱盐柱，一步进行样品的脱盐和缓冲液置换。但是，基于分子筛的脱盐和缓冲液置换可能会造成样品稀释，而好的电泳结果往往需要较高的蛋白浓度。因此，也可以使用超滤管进行浓缩和缓冲液置换。

针对高盐且浓度低的样品，可以直接选择哥家的 PlusOne SDS-PAGE Clean-Up Kit（货号：80648470），通过沉淀法去除去污剂、盐、脂质、酚类和核酸。

WB 实验需要定量，选择内参还是总蛋白做归一化？

使用总蛋白定量效果更好：

1）由于极少受到各种条件，如细胞处理和培养条件以及操作的影响，因此更可靠。

2）操作更方便，通过 QuickStain 蛋白预标记试剂盒（货号：RPN4000），使用荧光标记染料 Cy5 将蛋白样品预先标记上红色荧光，二抗孵育后直接使用 Typhoon 成像，无需加入 ECL 底物。同时在电泳和转印结束后，可分别对凝胶和膜成像，判断电泳和转印情况，监控实验流程。

3）荧光检测的方法具有更宽的检测范围和更强的蛋白信号。

凝胶电泳

哥家电泳仪：带有氧化铝陶瓷短板而散热功能更佳（散热能力是普通玻璃板 40 倍）的 SE250/260 小型垂垂直电泳仪，内置热交换和制冷功能；真正集凝胶灌制、电泳和印迹于一身的 mini VE 迷你型垂直电泳仪；兼容双向电泳的 SE600 标准垂直电泳仪（18 × 16 cm），可外接循环水浴。

什么情况下，该选择梯度胶？

聚丙烯酰胺凝胶中，小分子量蛋白移动快，更容易分离，而大分子量蛋白移动慢。当有多种分子量范围分布很宽的蛋白需要在同一张胶上进行分离，可能出现小分子量蛋白快跑出胶，而大分子量蛋白仍未得到有效分离。

此时建议使用梯度胶，小分子量蛋白运动至在胶浓度更高的底部（正极），同时大分子量蛋白在顶部有更好的分离。如下图：

图 3. 选择最佳的丙烯酰胺凝胶浓度达到高效的蛋白分离

在进行 WB 电泳时，是否需要加入 Marker？能够在最后的膜上曝光出来吗？

Amersham 预染分子量彩虹 Marker（全分子量 12 KD - 225KD，货号：RPN800E，火热促销 ing）可以在电泳过程中观察蛋白的运动，同时评估不同分子量蛋白的转膜效率。当然，还可以用于蛋白分子量的计算，利用哥家 IQTL 软件自带的分析功能，可对目的蛋白的化学发光成像结果和白光检测的预染 Marker 结果进行叠加，对 Marker 进行拟合（相对迁移距离 Rf 和分子量的 Log 值），计算目标蛋白分子量。

也可以选择 ECL DualVue 免疫印迹标准 Marker（货号：RPN810），包含 3 种 15k-100k 预染标记蛋白和 7 种 15k-150k 分子量标签重组蛋白。重组蛋白含有能够和 SRP 结合的多肽标签，S-protein-HRP 结合物在孵育一抗或二抗的过程中同时加入，通过和 ECL 底物反应后释放化学发光信号，因此条带能够通过胶片或 CCD 成像设备检测。

荧光多重检测方法中，可以选择能够通过 Cy3 和 Cy5 双通道检测的 ECL Plex 彩虹荧光 Marker（货号：RPN850E 或 RPN851E），具有更宽的线性范围。

转印

各种 NC 和 PVDF 膜，傻傻分不清楚？

请参考下表：

表 1. NC 膜和 PVDF 膜差异

如何选择不同的转印膜的孔径？

标准印迹膜的孔径是0.45 µm，适合检测分子量>20kDa 的蛋白，可以满足大部分实验需求。0.1 µm 孔径适合检测分子量<10kDa 的蛋白，0.2 µm 孔径适合检测分子量在 10-20kDa 之间的蛋白。

转印滤纸如何选择？

GB005（促销货号：10426981，200*200 mm）较厚，适合用于半干转印，利于避免转膜过程中胶干掉；

3 MM 纸（促销货号：3030-861，200*200 mm）是经典的用于湿转的印记滤纸，湿转也可以选择 GB003，厚度更大。

另外，GE 还提供 Amersham「三明治」印迹膜/ 滤纸组合，小伙伴们省去了分别剪裁的功夫。

转膜时候，膜和胶的相对位置如何，到底哪一个在正极？

通常情况下，转膜过程中，膜在胶的正极。蛋白带有负电荷，但不再是因为结合 SDS，而是因为常用的 Towbin 转膜缓冲液 pH 是 8.3，高于大部分蛋白等电点，造成带负电蛋白往阳极运动。如果某些蛋白的等电点高于缓冲液 pH 而带有正电荷，例如组蛋白和核糖体蛋白，则最好在阴极放一张膜。

图 4. 蛋白转印三明治示意图

手册中推荐转印缓冲液组成，如果是大分子蛋白，建议加入 0.1%SDS 和 10% 以下的甲醇；而小分子量转印，不要含 SDS，将甲醇量提高到 15-20%，是为什么？

事实上，SDS 的存在会阻碍蛋白与膜的结合，将胶在转膜缓冲液中预先平衡 15-30 min，有利于将 SDS 从胶上去除。但是，对于只能部分溶解的高分子量蛋白（容易在胶里形成沉淀）或含有过量的疏水氨基酸的样品，可以在转膜缓冲液中加入低浓度 SDS（0.02%-0.1%）促进蛋白转膜。

甲醇本身促进蛋白结合到膜（尤其是 NC 膜）上，部分是由于其去除了和蛋白结合的 SDS，因此加入到转膜缓冲液中。但是，甲醇可能会造成胶收缩，从而阻碍蛋白尤其是大分子量蛋白从胶上转移，且大分子转移时需要一定量的 SDS 促进溶解。因此，针对大分子量蛋白转印，需要将甲醇量降低至 10% 或以下，同时延长转膜前胶和缓冲液的预孵育时间，改善转印效率。

小分子量蛋白转印反之。

湿转和半干转印，如何选择？

请参考下表：

表 2. 湿转和半干转差异