细胞检测中 Flexstation 3 的快速动力学检测功能

在这些应用之中，钙流检测是快速动力学里最具代表性的一类。众所周知，钙离子是核心细胞信使，参与多数细胞信号转导的快速和长程调控。钙离子参与的细胞生理过程主要有胞外分泌、收缩、新陈代谢、转录、营养和增殖等众多方面，而 GPCR（G 蛋白偶连受体）则是引起细胞内钙离子浓度变化的一大类因素，通常这种钙离子浓度的变化十分快速且明显，故被称之为钙流。以下实验即是一则关于通过钙流检测验证 GPCR 与其配体结合的例子。

Nat Rev Mol Cell Biol. 2003 Jul;4(7):517-29.

靶向 A₁、A_2A、A_2B 和 A₃ 腺苷受体的激动剂有可能成为多种疾病的有效治疗选择，包括自身免疫性疾病、心血管疾病和癌症。因为这些腺苷受体在整个体内都具有不同的作用，因此获得高度特异性的受体激动剂至关重要。在这些受体中，腺苷 A_2AR 和 A_2BR 在序列和结构上有许多相似之处，但它们对炎症刺激的反应却有很大不同。

这篇文章中介绍的方法结合了专门开发的细胞系和钙释放分析硬件，创造了一种新的、更快的方法来测定合成腺苷激动剂化合物对人体细胞中 A_2A 和 A_2B 受体的特异性。A_2A 受体的表达被有效地从 K562 细胞中去除，导致形成一种明显的无效细胞系。利用 HIV 慢病毒载体和质粒 DNA 转染，此方法还建立了 A_2A 和 A_2B 受体的过表达系。众所周知，腺苷加入细胞培养物后会引起细胞内钙水平的变化，因此在添加化合物后，可以在这些细胞系中测定钙释放，从而提供受体激活的功能性读数，并能够分离出最特异的腺苷激动剂化合物。

检测细胞中钙流产生的方法如下：钙流检测试剂盒采用 FLIPR Calcium 3 Assay Explorer Kit（Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA）。96 孔板每孔接种 100 ul of 2.5 × 10⁵ K562 细胞，在悬浮细胞中加入相同体积的 Calcium Assay 3 Dye，37 °C 下孵育 1 小时。在单独的 96 孔板中制备激动剂化合物溶液，浓度比期望的最终浓度高 10 倍。将样品板放入 FlexStation 3 多功能微孔板读板机中并平衡 5 分钟。结合 SoftMax Pro 微孔板读数采集和分析软件（Molecular Devices），通过仪器自带的移液工作站自动添加化合物并读取每孔钙释放导致的荧光强度变化。

此方法首先开发出一种 CRISPR/Cas9 载体用于敲除 K562 细胞中的 A_2AR，作者设计的 gRNA 见下图所示，可以看出 gRNA #1 得分最高（左图），意味着脱靶率最低，作者将 BsmBI 剪切位点加入到 gRNA #1 中以便将其插入到 plentiCRISPR loxP 载体质粒 DNA 中（右图）。

作者紧接着又将 plentiCRISPR loxP A_2AR 病毒转染进 K562 细胞以产生稳定敲除 A_2AR 的 K562 细胞系，结合流式细胞仪检测到转染成功可达 96%（上图）；随后将 pcDNA3.1 ZEO T2A CRE-GFP 质粒转染进 A_2AR 敲除的 K562 细胞中以去除 loxP cassette，通过流式细胞仪可知有 32% 的转染细胞成功去除了 loxP cassette（下图），作者最终挑选出适合后续实验的 A_2AR 敲除细胞克隆。

然后通过分别转染可以表达 A_2AR 和 A_2BR 的载体到 K562 细胞中构建出过表达 A_2AR 和 A_2BR 的两种细胞系。由于作者缺少 A_2BR 抗体，无法直接验证 A_2BR 过表达细胞系，所以使用了一种已被广泛研究的 A_2BR 特异性激动剂 BAY60–6583 （BAY60）以检测添加了这种激动剂的 A_2BR 过表达细胞系的钙流产生情况，验证的结果如下：

作者使用了三种不同的细胞：野生型 K562 细胞（Naive）、敲除了 A_2AR 的 K562 细胞系（A2AR KO）和过表达 A_2BR 的 K562 细胞系（A_2BR OE），利用 FlexStation 3 快速检测这些细胞在加入了 A_2BR 激动剂后细胞中钙信号的变化情况，从曲线图中可以看出只有 A_2BR 过表达细胞系的钙信号强度明显上升，而其余细胞系的钙信号均接近基线，也证明了作者成功构建出 A_2BR 过表达细胞系。

作者再次使用从制药公司获得的 A_2AR 和 A_2BR 激动剂以检验其构建出的细胞系是否可以实际用于这两种腺苷受体对激动剂的特异性识别，一种是LNC-3047，一种是 LNC-3015，钙流检测结果如下：

从左半边图形中可以看出，添加了 LNC-3047 后，A_2AR 细胞系中的钙信号强度上升了（上图），但 A_2BR 细胞系中的钙信号却与基线一致，说明 LNC-3047 是 A_2AR 的特异性激动剂；反观 LNC-3015 处理后的细胞系，在两种过表达受体的细胞系中均表现出明显高于基线的钙信号强度，说明 LNC-3015 可以同时结合这两种受体而引起细胞中产生钙流。以上结果很好的证明了此方法所开发出的 K562 工程细胞系特异性识别两种受体激动剂的有效性。