随着时代的发展，Mixed-mode色谱柱越来越受到了研究人员的关注。同一般反相色谱柱相比，Mixed-mode色谱柱可以提供疏水，亲水，离子交换和离子排斥等多重作用，功能机理如图1所示。其复杂程度远高于一般的以疏水作用为主的C18柱。
图1.Mixed-Mode 色谱柱作用机理
由于存在多种作用，Mixed-mode色谱柱往往被用来解决强亲水性化合物的保留差问题，如图2。通过调整有机相溶剂比，缓冲液浓度，流动相pH，调整疏水，亲水或离子交换的作用力的强弱，从而实现极性和非极性，可离子化和中性等目标物的分离分析。
图2.Mixed-mode 色谱柱集合了多种作用
Mixed-mode色谱柱的种类繁多，广州菲罗门公司引领技术的发展的潮流，推出了多款不同功能的特征的Mixed-mode色谱柱，如表1所示。
色谱柱型号 | 键合类型 | 存在的主要作用机制 |
Comixshell CARP | 阴离子+疏水链 | 疏水+阳离子交换（阴离子排阻）+HILIC |
Comixsil ACRP | 阴离子+阳离子+亲水链 | HILIC+阴/阳离子交换/排阻 |
Comixsil RPAC | 阴离子+阳离子+疏水链 | 阴/阳离子交换/排阻+疏水+HILIC |
Comixsil RP-CX | 阴离子+疏水链 | 阳离子交换（阴离子排阻）+疏水+HILIC |
Comixsil RP-100 | 阴离子+疏水链 | 阳离子交换（阴离子排阻）+疏水+HILIC |
Comixsil HCS | 阴离子+短疏水链 | HILIC+阳离子交换（阴离子排阻） |
Comixshell AIRP | 阳离子+疏水链 | 阴离子交换（阳离子排阻）+疏水+HILIC |
Comixsil RP-AX | 阳离子+疏水链 | 阴离子交换（阳离子排阻）+疏水+HILIC |
表1.菲罗门Mixed-Mode色谱柱及其主要作用机制
在本研究中研究了广州菲罗门公司的带有反相和阳离子交换色谱柱Comixsil RP-100与典型的反相保留差的弱碱性化合物的保留影响因素，进行了模型化和数学化的分析。
图3. Comixsil RP-100固定相组成示意图
图4.被分析对象的结构以及基于ACD pH Selector的示意图
从图4可见，总体而言三个目标化合物的疏水性在酸性条件下是有疏水性能是有明显区分的。对于1号和3号化合物来说，在pH=2时的logD大小约在-3到-2之间，因此强酸性条件下的保留风险大。化合物2同化合物1相比疏水性大了不少，纵轴方向有明显的距离。整体来说，酸性条件下三个目标物的保留都较差，适合使用离液剂或者离子对。本例使用Comixsil RP-100色谱柱，其具备阳离子交换和反相保留的特点，在酸性条件下对目标物进行分离研究。经过研究，使用以下表2的色谱条件，能够对目标物有良好的保留，达到令人满意的的分离效果。
T/min | ACN% | H2O% | 1%H2SO4 |
0 | 0 | 90 | 10 |
15 | 80 | 0 | 20 |
表2.色谱条件
图5.目标物质的分离典型谱图
从图5可见，与logD谱图相比，这三个目标物的保留显示出有趣的保留变化。比较化合物1和2，两个化合物电离性接近，化合物2比化合物1多了溴取代而疏水性增加，保留增大，色谱保留上体现出了comixsil RP-100的疏水选择性。比较化合物1和3，化合物3在强酸性双电离化，其保留相较化合物1增大很多，体现出明显的离子交换的作用增大保留的能力。比较化合物2和3的保留行为，化合物3的保留增大的效果强于化合物2，可以判断离子交换能力的作用强度超过了疏水作用。
在本例中能够影响化合物在Comixsil RP-100的保留的因素有：
有机相的比例，会改变流动相疏水洗脱的能力
硫酸的浓度，会影响固定相的电离状态从而影响离子交换的强度
pH，会改变固定相和化合物的电离状态，从而改变它们之间的离子交换强度
因此设计了以下的三组实验分别进行梯度，酸浓度以及pH对保留的影响。准备进行拟合的目标函数包括：
1 lnk=a+bX
2 lnk=a+bX+cX2
3 lnk=a+bX+cX2+dX3
4 lnk=a+blnX+clnX2
5 lnk=a+bX+cX1/3
等函数，使用的软件为ACD/Labs的LC-Simulator建模软件。以期发现影响因素与保留因子的函数关系，为今后对Mixed-Mode色谱柱的分离数据模型的构建做一些基础性的探索。
三组单因素设计如下：
A: 梯度单因素研究方案：
1. 梯度时间10min:
| T/min | ACN% | H2O% | 1%H2SO4 |
| 0 | 0 | 90 | 10 |
| 10 | 80 | 0 | 20 |
2. 梯度时间15min:
| T/min | ACN% | H2O% | 1%H2SO4 |
| 0 | 0 | 90 | 10 |
| 15 | 80 | 0 | 20 |
3. 梯度时间20min:
| T/min | ACN% | H2O% | 1%H2SO4 |
| 0 | 0 | 90 | 10 |
| 20 | 80 | 0 | 20 |
| T/min | ACN% | H2O% | 1%H2SO4 |
| 0 | 0 | 90 | 10 |
| 25 | 80 | 0 | 20 |
B. 硫酸浓度研究方案：
1. 硫酸浓度为0.05%
| T/min | ACN% | H2O% | 1%H2SO4 |
| 0 | 0 | 95 | 5 |
| 15 | 80 | 15 | 5 |
2. 硫酸浓度为0.1%
| T/min | ACN% | H2O% | 1%H2SO4 |
| 0 | 0 | 90 | 10 |
| 15 | 80 | 10 | 10 |
3. 硫酸浓度为0.15%
| T/min | ACN% | H2O% | 1%H2SO4 |
| 0 | 0 | 85 | 15 |
| 15 | 80 | 5 | 15 |
4. 硫酸浓度为0.2%
| T/min | ACN% | H2O% | 1%H2SO4 |
| 0 | 0 | 80 | 20 |
| 15 | 80 | 0 | 20 |
C．pH研究方案：
1. pH 1.32
| T/min | ACN% | 0.2%H2SO4 | 250 mM NaoH |
| 0 | 0 | 100 | 0 |
| 15 | 80 | 20 | 0 |
2. pH 1.62
| T/min | ACN% | 0.2%H2SO4 | 250 mM NaoH |
| 0 | 0 | 90 | 10 |
| 15 | 80 | 18 | 2 |
3. pH 2.1
| T/min | ACN% | 0.2%H2SO4 | 250 mM NaoH |
| 0 | 0 | 82 | 18 |
| 15 | 80 | 16.4 | 3.6 |
4. pH 2.93
| T/min | ACN% | 0.2%H2SO4 | 250 mM NaoH |
| 0 | 0 | 78 | 22 |
| 15 | 80 | 15.6 | 4.4 |
在Agilent 1200 HPLC 四元泵Chemstation工作站上执行以上设计，将采集后的数据用Spectrus Processor进行标峰处理，然后推送给LC-Simulator建模，切换不同的函数，考察各函数的和保留因子的拟合情况分别获得梯度、酸浓度和pH的最佳拟合函数。
A组梯度单因素实验函数拟合结果显示如图6a，最佳函数为lnk=a+bX+cX2，以化合物3为例统计学指标如图6b所示.
图6a.梯度拟合函数lnk=a+bX+cX2
图6b.化合物3的二次项函数表达式及其的统计学指标
图7a.酸浓度拟合函数lnk=a+bX+cX1/3
图7b.化合物3的最佳拟合函数表达式及其统计学指标
图8a.pH拟合函数lnk=a+bX+cX2+dX3
图8b.化合物2的最佳拟合函数表达式及其统计学指标
图8c.化合物2的最佳拟合函数的拟合情况
从以上的拟合函数可以发现，混合模式色谱柱的梯度函数为非线性函数，与一般的常见的反相梯度函数有所不同；酸浓度的函数是常见的浓度函数；pH则最为特别，是三次函数。
以上的研究提示我们，在进行混合模式色谱柱上单因素或者多因素研究时要特别注意选用合适的拟合函数，应安排足够数量的实验，对函数表达式进行筛选使用。
Mixed-mode色谱柱机理较为复杂，一般不会像C18一样被用来做简单的色谱柱筛选。在方法开发过程中，分析工作者要了解分析物的电离化特性和亲/疏水性特性，评估与色谱柱固定相所能提供的作用力的匹配程度来更精准地选择合适的Mixed-mode色谱柱；使用过程中需要注意色谱柱上嵌入基团的pKa，通过调节流动相的pH值使色谱柱上的基团的离子化状态处于合理的状态，从而使分析物与固定相之间存在合适的离子作用力。ACD/Percepta软件可以准确预测目标物的pKa和logD，帮助分析工作者更好地选择色谱柱。在进行方法分离优化时，影响分离效果的主要要素是有机溶剂的比例、缓冲盐的种类和浓度以及流动相pH。
Happy Mix!
禹飞乐：广州菲罗门技术总监
李 丹：ACD/Labs中国区技术支持专家
阎作伟：ACD/Labs中国区经理
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