概述
单克隆抗体是一类重要的治疗药物，拥有治疗多种疾病的巨大潜力。由于其结构具有高度复杂性和聚糖异质性，因此必须对其关键质量属性进行表征和严格控制，才能保证药物的质量和功效。与Fc区Asn-297糖基化位点相连的mAb聚糖会影响生物活性，如抗体依赖性细胞毒性 (ADCC) 和稳定性。
TSKgel FcR-IIIA色谱柱根据单克隆抗体对FcγRIIIA配体的亲和力，将其分为3个组分：低亲和力、中亲和力和高亲和力。这主要取决于mAb的糖型及其ADCC活性。为了定量和阐明基于FcR-IIIA亲和力分离的不同组分糖型聚糖谱，需要首先对馏分中的抗体聚糖进行释放并标记，再使用HILIC-MS的分析。
TSKgel FcR-IIIA-5PW是一种半制备型亲和色谱柱，其固定相是将重组FcγRIIIA配基，键合到10 μm粒径的多孔聚甲基丙烯酸酯聚合物基质上，上样量最高可达5 mg mAb。它与分析柱 (TSKgel FcR-IIIA-NPR) 不同，分析柱采用的是无孔填料基质，上样量通常 ≤50 μg mAb。因此，使用半制备型TSKgel FcR-IIIA-5PW色谱柱，单次可收集更多的样品，对这一工作流程大有裨益。该半制备型色谱柱的附加效用是可以通过收集足量的样品，通过酶促聚糖释放和HILIC-MS方法对mAb糖型进行深度分析。
▼分析释放聚糖的新工作流程
实验部分
图1是使用TSKgel FcR-IIIA-5PW半制备型色谱柱分析Protein A纯化后的曲妥珠单抗的色谱图。该峰轮廓与TSKgel FcR-IIIA-NPR分析柱相当，随着pH值的降低，首先显示的是低亲和力，其后依次是中亲和力和高亲和力组分。我们从收集的峰1、2和3中释放并标记了聚糖，然后将其进样到与MS相连的TSKgel Amide-80 HILIC色谱柱中对聚糖进行定量分析。
图1 Herceptin生物仿制药在FcR色谱柱上的洗脱曲线
图2 HILIC-MS分析FcR组分释放的聚糖时的相对强度
图3中TSKgel Amide-80色谱柱与质谱联用表明，与FcγRIIIA配基 (峰3) 亲和力最高的mAb糖型，其N-聚糖结构 (G1F和G2F聚糖符号) 中半乳糖的含量也最高。峰2相对于峰1显示出了更高的G1F水平，峰1含有更丰富的岩藻糖基化聚糖，不含末端半乳糖 (G0F)。
图3 FcR色谱柱收集的组分中3个峰内6种不同N-聚糖的相对丰度
总结
半制备型TSKgel FcR-IIIA亲和色谱分离和HILIC分析，组成了一个两步工作流程，可快速筛选上下游的mAb产品。利用HILIC-MS可以确认不同mAb糖型中N-聚糖的有无及其相对数量，从而对mAb进行深度表征。此类分析几乎可在任何质谱仪上进行，无需高分辨率设备。在正交色谱方法中使用相同样品材料的额外好处是，为药物开发和质量控制创造了全新优势。该工作流程的优势还包括，无需进行昂贵且费时费力的生物活性测定，就能够监测到FcγRIIIA的亲和力及其相对ADCC活性。
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