药物中基因毒性杂质测定方法的系统开发策略

摘要:药品中微量基因毒性杂质(GTIs)的分析和控制需要精确、准确和稳定的分析方法。由于需要将大多数基因毒性杂质控制在ppm水平以下，再加上基因毒性杂质经常具有活性和不稳定性，因此对分析提出了重大挑战。这篇文章报告了一个系统的基因毒性杂质方法开发策略(MDS)，基于我们近年来在基因毒性杂质分析中的成功经验和质量设计(QbD)原则，强调在方法中构建预期的方法性能。它从一个预先确定的方法目标开始，接着是方法开发和风险控制策略。由于基因毒性杂质分析的性质，包含复杂的分析方法，如化学衍生化和质谱检测，特别是在药物开发的研究和开发(R&D)阶段。这种方法通常比传统的药物分析方法包含更多的变量。因此，良好的科学认识和风险控制策略对于保证跟踪基因毒性杂质分析的方法性能至关重要。对于在缺乏精密仪器和熟练分析人员的生产质量控制实验室中实施的方法，除了方法的准确性外，方法的简便性、稳定性和耐用性更加突出。本文介绍了采用QbD原理来开发此类方法的优势，包括对最近批准的药物盐酸帕唑帕尼(维全特)中硫酸二甲酯的分析。

01

介绍

药物基因毒性杂质可能会潜在地增加患者得癌症的风险，最近已受到监管机构和制药企业的相当多的关注^[1]。欧洲药品管理局(EMEA)已经发布了关于原料药和制剂中潜在基因毒性杂质控制的初步指南^[2]，美国食品和药物管理局(FDA)最近也在网上发布了一份指导文件草案^[3]。因此，制药企业正在积极寻求监测和控制原料药和药品中基因毒性杂质水平的策略。潜在的基因毒性杂质可能是在生产过程和储存过程中产生的微量工艺杂质和/或降解物。

表1美国FDA和EMEA建议临床研究中药物中基因毒性杂质的可接受合格阈值

尽管近年来在开发用于分析单个或一系列基因毒性杂质的灵敏方法方面取得了很大的进展^[4-6]，但用于开发稳定、重现性好的方法的系统策略仍然缺乏。此外，目前监管部门对药品质量设计(QbD)的关注要求对基因毒性杂质分析中的分析方法开发过程进行更仔细的研究^[7-10]。我们实验室最近的出版物中介绍了成功应用QbD原理和策略开发出的HPLC和卡尔费休滴定法^[11,12]。本文的目的是讨论使用系统的方法开发策略(MDS)，开发用于检测原料药或制剂中基因毒性杂质的稳定方法。本文提出的基因毒性杂质方法开发策略与之前论文中举例的遵循了相同的科学和基于风险评估的方法，如图1所示的流程图所示，并提供了真实的药物开发案例。

图1.在制药QbD环境中系统地开发GTI分析方法。

02

方法的目标

在开始基因毒性杂质分析方法开发之前，第一步是明确检测的目的，该方法将在哪里实施以及结果将如何使用。测试的目的定义了对方法灵敏度和准确度的要求。在方法目标设定过程中，必须考虑以下几个因素：(1)该方法是用于批量放行检测还是仅用于实验研究(例如，掺杂/清除研究、稳定性监测等)；(2)方法灵敏度、准确度和精密度的要求(是否需要进行限度或定量检测)；(3)最终用户和方法复杂性的考虑(该方法是为研究和开发的还是用于生产分析实验室的)。

对于最终原料药或制剂的放行测试，根据法规要求，必要的方法灵敏度通常在ppm级别内。如果有必要，检测上市产品的方法可能需要在QC实验室中进行。这将对方法的复杂性、工具的可得性以及分析人员的专业知识产生影响^[13]。例如，在典型的QC实验室中，诸如质谱仪之类的仪器可能不容易获得，而分析人员可能没有接受过操作此类仪器或复杂样品制备程序的培训。因此，在生产QC实验室中，简单、常规的方法是首选。复杂和非常规的方法，如LC/MS，可能需要额外的委托送检，这需要尽早与利益相关者进行讨论。

QbD制药提倡将质量构建到过程中，即基因毒性杂质限度可以基于对工艺理解的基础上在过程中控制，而不是仅仅依靠最终产品的检测。这需要对生产工艺进行广泛的调查，从中可以发现控制上游基因毒性杂质的机会，例如控制起始原料或合成反应中间体中的基因毒性杂质^[14]。为了推进对工艺的理解，需要进行重要的掺杂/清除实验。对于这类分析，中间体中的基因毒性杂质水平通常要比活性药物成分(API)要求的高得多。因此，较不敏感和较不稳定的方法可能就足够了。因为这种实验通常是在实验室规模的研发中进行的，在仪器方面的方法复杂性和分析者的专业知识通常不需要担心。

目前在基因毒性杂质检测中使用的是限度检测和定量检测，对方法的灵敏度和准确度有不同的要求。限度检测本质上是将样品中分析物的浓度与已知标准品的浓度进行比较，结果报告为不大于或大于(通过或不通过)标准品的浓度。这与定量分析不同，定量分析中分析物的水平或浓度是数字报告的。限度检测方法不能够像定量方法进行有效地验证^[15]。对于上市产品中的原料药，应该对原料药中某一基因毒性杂质的实际水平进行了很好的描述。如果基因毒性杂质的实际水平远低于规范要求，则限度检测足够作为最终产品的放行分析。如果基因毒性杂质水平接近规范要求，或基因毒性杂质是降解产物，在生产或储存过程中可能会升高，则一般首选定量分析。此外，在了解合成过程的中间步骤后，可能需要定量方法来监测基因毒性杂质的实际水平；对于后期开发的化合物来说尤其如此。

总之，一个方法目标应该包括但不限于测试的目的、测试的限度、方法的类型、准确度要求、最终用户、仪器能力和接收实验室的限制。下面的例子描述了典型的方法目标是如何开发的。

2.1 案例分析1：分析帕唑帕尼原料药中硫酸二甲酯(DMS)的方法目标

用于合成帕佐帕尼的起始物料需要用到基因毒性硫酸二甲酯(DMS)作为试剂^[14]。在帕唑帕尼的临床开发过程中，需要一种灵敏的方法来证明最终原料药中不存在硫酸二甲酯这一杂质。此外，为了支持硫酸二甲酯掺杂/清楚研究的过程控制策略的发展，需要一种灵敏度和选择性都好的定量方法来测定原料药中1.7ppm(w/w)的硫酸二甲酯水平^[16]。由于该方法的目的是用于研发，方法和仪器的复杂性不是主要关注的问题，而方法的灵敏度和选择性是方法开发的关键因素。因此，该方法不受样品制备方法、分离技术和检测方案的限制。可以将方法的目标设定为开发一种定量方法来测定原料药中的硫酸二甲酯，其定量限(LOQ)为1.7ppm或更低。

2.2 案例分析2：分析帕佐帕尼起始物料中硫酸二甲酯(DMS)的方法目标

根据掺杂/清除研究的工艺知识，在最终生产过程中，可以有效地清除起始物料中高达5%(w/w)的硫酸二甲酯^[14]。因此，设定0.1%(最高检测水平的1/50)作为起始物料中硫酸二甲酯的限度。在这种情况下，硫酸二甲酯的分析控制转移到上游的起始物料，需要第二种方法能够分析起始物料中0.1%的硫酸二甲酯^[14]。因此，与前面的案例相比，方法的目标在几个方面完全改变了。首先，目标控制级别变成百分比级别，而不是ppm级别。其次，该方法必须转移到生产QC实验室，因此，仪器的可用性和方法的简单性以及方法的稳定性和耐用性是至关重要的。第三，由于通常的硫酸二甲酯含量在起始物料中远远低于0.1%，并且遵循方法的简单化需求，一个限度方法将满足项目的需要。因此，该方法的目标，即开发一种可以检测0.1%水平硫酸二甲酯的限度检测方法，该方法应易于在指定的生产QC实验室实施。

2.3 方法的筛选与评价

基因毒性杂质包括广泛的化学结构。由于其各种不同的物理化学性质需要各种分析方法，以达到所需的方法灵敏度。例如，一些基因毒性杂质是小的挥发性分子，如烷基卤化物，而另一些则是非挥发性合成中间体；有些具有化学反应性，而另一些则相对稳定。此外，样品基质(包括原料药、少量杂质、辅料和溶剂)可能对分析方法的选择有很大影响。理解分析物的性质、分子结构的功能，是成功设计合适方法的关键。分析物和样品基质的性质决定了使用何种样品制备、分离和检测技术。因此，本文的方法探寻与评价过程是书面上的设计与实验室验证相结合的过程。书面上的练习是一种经济而有效的开始方法。然而，这种方法将不可避免地依赖分析人员对分析物和样品基质的了解和经验。设计过程的输出是一个潜在方法的列表，根据它们的灵敏度、复杂性、准确性和最终用户的限制，从最有希望的到最不希望进行排序。从分析过程的角度来看，痕量分析方法可以分解为样品制备、分离和检测三个技术单元操作，虽然它们不是完全独立的，例如特定的样品制备程序是针对特定的检测方法设计的。每个单元操作可能有多个选择，需要单独进行全面的评估。各单元操作的相对复杂度如图2所示。

图2.根据复杂性对技术进行排序。

2.4 样品制备

样品制备对基因毒性杂质的分析很重要，因为在痕量分析中基质效应会被放大，导致灵敏度下降、异常回收率和分析物不稳定性^[17]。最简单的样品制备方法是在液相色谱(LC)和气相色谱(GC)中进行“溶解并注入”(或液体样品的“稀释并注入”)。对于气相色谱法，顶空进样是首选的方法，以避免注入高浓度的API。这些技术通常在大多数实验室都可以使用。

另一方面，基质失活是我们实验室开发的一种特殊的样品处理技术，用于稳定某些活性和不稳定的分析物^[17]。基质失活使这些分析物在GC或LC色谱条件下得到保留。首先，对分析物的降解机理有很好的理解，或者至少能够根据化学结构进行有根据的猜测。基质失活是假设某种分析物的降解是由样品基质中的某些化学物质引起或催化的，去除或降低干扰的化学物质活性将提高分析物的稳定性。该方法简单地将选定的试剂添加到样品稀释剂中，因此不会增加分析方法常规操作的复杂性。包括液-液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)在内的样品提取技术是浓缩分析物或去除干扰样品基质的有效工具，广泛应用于生物分析中。然而，这些样品提取技术在分析中增加了操作步骤，并且最后得到的方法需要额外验证。因此，提取样品只能作为最后的手段^[18]。尽管如此，当处理复杂辅料时，它在药品分析中可能是潜在的好处。最后，分析物的化学衍生法是一种通用的技术，可以用来修改分析物的物理化学性质。通过化学衍生法，不稳定的分析物可以稳定，或者可以在不易检测的分析物中加入独特的结构片段，以改善检测和/或分离^[19,20]。衍生化试剂的选择在很大程度上取决于分析物中的官能团以及预期的分离和/或检测技术。

2.5 分离技术的选择

在药物分析中最常见和通用的分离技术是HPLC和GC，而其他的如离子色谱(IC)、毛细管电泳(CE)和超临界流体色谱(SFC)在基因毒性杂质分析中没有相关有用的文献。根据基因毒性杂质的挥发性可分为两组，根据分析物的挥发度选择HPLC和GC。对于非挥发性分析物，反相高效液相色谱(RP-HPLC)是最常用的色谱模式。许多类型的反相-高效液相色谱柱固定相用于分离各种药物分子。亲水作用液相色谱(HILIC)是反相高效液相色谱(RP-HPLC)的补充，对极性分析物的分离非常有用^[16]。

另外挥发性化合物可以用GC进行分离。在气相色谱分析中，顶空进样增加了色谱分离的另一个维度，非挥发性原料药不被引入气相色谱系统。因此，对于热稳定的挥发性化合物，顶空是样品进样的首选方式。另一方面，直接进样不可避免地会将大量的API引入GC系统，从而污染进样口、GC色谱柱或检测器。可能需要更频繁地清洗仪器。最近，二维气相色谱技术如反冲和中心切割分析已被应用于基因毒性杂质分析，只需要将包含目标分析物的一小部分体积引入质谱检测器或第二根色谱柱，从而最大限度的减少对仪器的污染^[21]。

2.6 检测方法的选择

在药物分析中，紫外检测器是HPLC中目前最常用的检测器，而火焰离子化检测器(FID)是GC的标准检测器。从仪器的简易性、稳定性和可用性的角度来看，当该方法打算用于QC实验室时，这些标准仪器应被视为首选的方法。然而，在微量基因毒性杂质分析中，它们往往不能提供足够的灵敏度。当基因毒性杂质由卤素组成时，电子捕获检测器(ECD)可以很好地替代FID，为检测提供了额外的选择性。从最近的文献中可以看出，灵敏度和选择性良好的质谱检测在基因毒性杂质分析中发挥着主导作用。四极杆质谱分析仪是定量分析的标准设备，选择性离子监测(SIM)或多反应监测(MRM)是最常用的检测方式。选择性离子监测通常在单四极质谱仪器上实现，而多反应监测需要更复杂的三重四极质谱仪器。在将方法转移到QC实验室过程中，使用质谱检测的缺点是明显的，首先要考虑的是要投入更多的资本以及经过专门培训的操作人员。因此，一般来说，在生产实验室进行基因毒性杂质分析时，质谱检测应是最后的手段，如果可能，应尽量避免采用高端三重四极杆的多反应监测方法，尽管它可能会在样品反应方面增加方法的稳定性。将基于质谱的方法转移到QC实验室是可能的，但不是我们所期望的；当药物开发计划接近后期时，应该全面探索其他的替代方法。然而，在临床开发阶段，质谱在药物分析中扮演着越来越重要的角色，因为仪器的可行性(特别是单四极杆质谱)不再是一个问题。质谱检测具有较高的选择性和灵敏度，有利于基因毒性杂质方法的开发。在近期的论文中提到了尝试使用其他探测器，如带蒸发光散射检测器(ELSD)和电雾式检测器(CAD)的高效液相色谱，但真正的好处尚未发现^[6]。荧光检测器(FLD)的应用虽然很有前景，但尚未见报道。

2.7 方法设计与评价

方法设计和评价是通过综合考虑以下因素来实现的：已确定的方法目标，分析物和样品基质的性质，以及分析技术在每个单元操作中的能力。一般来说，应该为每个单元操作选择最简单的技术。例如，药物分析中的常规分析仪器，如带UV检测的高效液相色谱(用于典型的非挥发性分析物)或带FID检测的GC(用于挥发性小分子)，应作为基因毒性杂质分析的标准首次尝试。然而，由此产生的方法可能不一定能提供方法目标中期望的灵敏度。通常，可以在理论的模拟和分析师的知识以及文献报告的基础上，提出多种方法。潜在的方法应该根据它们的灵敏性和复杂性进行排序。我们开发了如图3所示的系统决策树来辅助方法设计和评价过程。

图3.设计基因毒性杂质分析方法的决策树。

决策树首先考虑分析物是否在API中的溶液稳定性。分析物在溶液中的稳定性决定了是否需要样品制备程序，而不是“溶解和进样”。在分析物稳定性较差的情况下，通常可以通过物理措施来提高稳定性，如将样品保存在低温或避光的条件下。根据分析物和样品基质的性质，可以使用更有效的化学措施，如基质失活或化学衍生化法^[17,19,22]。下一步是检查分析物(或其衍生化产物)的挥发性，这决定了它是更适合GC还是LC。同样，可以根据分子的性质选择合适的检测技术。如果没有一种检测方法满足方法目标的要求(特别是灵敏度)，则需要考虑不同的化学衍生化方法。为了使分析物符合所需要的分离和检测技术，可以制备各种类型的衍生物。样品浓缩技术，如液-液萃取和固相萃取，不包括在决策树中，由于其过程的复杂性它们不是首选的。但是，这并不排除在必要的特殊情况下使用它们的可能。值得一提的是，这三个单元的操作并不是完全独立的，应该始终进行整体评估。

在方法排序之后，应该对最有前途的方法进行实验评估。例如，如果涉及到衍生化，衍生化反应总是要进行概念验证测试。衍生化产物可通过通用的GC-MS或LC-MS法进行快速评价，从而充分了解衍生化产物的特性。理想反应是快速并且选择性好的，同时预期产品的产量高副产物少。此外，API峰或其他干扰无的分离也必须加以评估。理想情况下，分离度应大于4，以防止大量原料药的任何不利影响，特别是当分析物在原料药后被洗脱时。如果采用非专属性检测方法，对其他干扰峰的分离度应大于2。此外，样品制备应进行评估，以检查分析物在分析过程中是否具有足够的稳定性。如果没有，应探索基质失活方法来稳定分析物。根据我们的经验，这是一种至关重要的手段，以确保所需的灵敏度，线性，和准确性的方法。最后，评估方法的灵敏度、线性、准确度和精密度。方法评估过程中出现的问题，如分析物的意外溶液不稳定性，应予以相应的处理，并以相同的方式对修改后的方法进行重新评估。

2.8 案例分析3：根据方法目标设计和评价帕唑帕尼原料药和起始物料中硫酸二甲酯(DMS)的检测方法。

以上述硫酸二甲酯分析为例，由于分析物本身非常不稳定，基于文献资料，衍生化是首选的方法^[5,23,24]。虽然已经开发了“稀释并进样”的方法，但有一定的局限性。衍生化试剂的选择必须考虑到分离和检测技术的背景。例如，Jacq等人使用五氟苯硫酚作为衍生试剂，将硫酸二甲酯转化为具有挥发性的甲基五氟苯硫酚，可使用GC/MS顶空进样进行分析^[24]，作者建议使用内标物(IS)以确保方法的准确性。An和同时用三乙胺将硫酸二甲酯转化为季铵盐，用HILIC/MS进行分析^[16]。Liu和同事们开发了一种2-巯基吡啶衍生化方法，用于0.1%水平的硫酸二甲酯分析，该方法可以很容易地在传统的HPLC/UV仪器上实现^[14]。由于使用了基于质谱的检测技术，前两种方法提供了低ppm级的灵敏度和优越的选择性。基于MS的方法可以很容易地在研发实验室中实现，但它们在QC实验室中却不是首选。第三种LC/UV的衍生化法灵敏度为0.1%，但分离检测技术简单。上述基于MS或UV的方法需要在方法目标的范围内加以评价。因此，选择MS的方法作为API的分析，以建立在对开发过程的理解，而选择基于UV的方法用于在生产现场的QC实验室检测和控制起始原料中的硫酸二甲酯，满足了案例研究1和2中描述的方法目标^[14]。

03

方法选择和风险评估

经过上述方法的评估，包括经过概念测试的初步证明支持的理论练习，现在可以选择一种方法进行进一步的研究。这本质上是一个方法的优化步骤，根据方法目标对各种方法参数进行优化。应提出和分组可能影响方法性能的因素，并进行风险评估以及稳定性和耐用性研究。风险评估以及稳定性和耐用性研究可以有效地调查方法变量，并理解它们对方法性能的相对重要性。这将可以识别出关键的方法参数，这些参数应该在方法的整个生命周期中受到密切监视和严格控制。值得一提的是，风险评估、稳定性和耐用性是针对生产工厂中产品整个生命周期的方法，而不是用于研究目的的方法。然而，这并不排除风险评估工具在研发优化方法中的使用。

3.1 案例研究4：对硫酸二甲酯HPLC/UV限度法的稳定性和耐用性研究。

根据工艺理解，即帕唑帕尼生产过程中硫酸二甲酯的可消除性，可以将硫酸二甲酯控制在起始物料上游0.1%的水平^[14]。因此，在案例研究3中设计的衍生化LC/UV方法可以在生产场地进行使用。衍生化反应包括使用2-巯基吡啶与硫酸二甲酯反应生成2-甲基噻吩吡啶，该反应可通过HPLC/UV进行监测(方法细节见表2)。

表2.HPLC/UV方法的条件用于帕唑帕尼起始原料中硫酸二甲酯的测定

为了确认方法变量，使用鱼骨图进行了风险评估(图4)。将变量分为六类。三个单元操作中的每一个都是一个类别，人员、材料、设施和设备是其他类别。每个变量被指定为受控(C)、实验(X)或响应(N)。受控变量将通过实验室实践进行控制。使用实验设计(DOE)^[11]或单变量实验^[13]将关键实验变量输入稳健性研究。响应变量将在耐用性研究期间使用测量分析系统进行评估。对于硫酸二甲酯衍生化的LC/UV方法，根据4名分析人员在鱼骨图练习中给予的评分，确定了3个高风险实验变量。它们是流动相七氟丁酸(HFBA)的浓度、衍生化反应温度和色谱柱稳定性。这些变量被输入稳定性研究中，在定义的范围内根据方法属性(如保留时间、灵敏度、回收率、峰分离度和峰尾因子)对变量进行评估。因此，确定了这三个变量的可接受范围。确定适宜的衍生化反应温度范围为55-65℃；HFBA含量(±20%)对结果无影响；该色谱柱至少持续进样200次。响应变量通过使用5个样本、2个分析者、2个色谱柱和2个仪器在2天不同的耐用性测试来评估^[11]。表3和表4总结了耐用性结果。结果表明，响应变量对在样品中硫酸二甲酯的检测结果没有显著影响。因此，可以得出结论，开发出一种稳定耐用的方法。

图4.HPLC/UV法测定帕唑帕尼起始材料中硫酸二甲酯的鱼骨图。

表3.硫酸二甲酯方法的中间精密度证明：重复五次制备加标0.1%(w/w) 硫酸二甲酯的帕唑帕尼起始物料

表4.硫酸二甲酯方法的中间精密度证明：六次进样加标0.1%(w/w) 硫酸二甲酯的帕唑帕尼起始物料

04

方法性能控制策略

通过对稳定性和耐用性的研究，可以提高对各种条件下方法性能的整体理解。因此，可以定义分析方法性能控制策略以及适当的系统适用性标准，以管理方法风险，并确保方法提供所需的性能。典型的系统适用性标准可能包括表5中列出的试验。与方法没有直接关系的变量也很重要。由于基因毒性杂质分析方法是处理微量分析物，在实验进行期间，分析人员的良好实验室操作是至关重要的。特别是，应制定系统控制策略，以防止样品污染，导致可能影响分析结果。根据我们的经验，必须建立受控样品分离系统和泄漏控制/预防程序。此外，玻璃器皿的清洁度、正确的移液管操作以及个人防护设备（如手套和清洁度）的状态，再怎么强调也不过分。对于挥发性基因毒性杂质分析物，分析物蒸发可能导致样品交叉污染。在这种情况下，强烈推荐要注意标准品和样品的制备要及时(样品第一，标准第二)和/或空间分开(单独的化学罩)。

表5.系统适用性检测

4.1 基于MS方法的其他注意事项

众所周知，向样品中添加内标物（IS）可以补偿基于MS方法的样品制备、分离、电离和仪器性能的变化^[25]。该方法也在一定程度上用于解决分析物稳定性问题^[24]。稳定同位素标记的类似物和结构相关的类似物都可以达到这一目的。当内标物水平在分析物范围内的系数为10时^[26]，带有同位素标记内标物的MS方法可以为痕量分析提供最可靠的结果，即使使用单点校准，也可以获得准确的结果^[27]。因此，在基因毒性杂质分析方法中使用内标物可以在方法中建立额外的数据准确性和方法稳定性。对于基于MS的方法，尤其是当基因毒性杂质水平接近测试极限时，建议使用内标物，并且该方法可能用于生产QC实验室。在这种情况下，单点校准可用于定量或极限试验方法的常规分析。如果内标物不可用，则需要进行额外的风险评估，以识别潜在风险，并应制定方法性能控制计划，以减轻风险。

基于MS的方法，由于质谱的高度专属性和灵敏度，与非专属性检测技术（例如UV）相比，在样品变化的耐受性方面，通常客源提供额外的稳定性和耐用性。然而，质谱检测涉及多个步骤，包括样品引入、电离、离子传输、离子分离和检测。来自不同供应商的仪器的每个阶段都是独特设计的，因此在来自不同供应商的仪器之间传输方法可能需要优化多个仪器参数。接收实验室中的仪器，即使是同一型号，也可能与用于方法开发的仪器性能不完全相同，因为仪器性能和仪器历史存在遗传差异。因此，方法开发实验室和接收实验室质谱中的两台仪器应尽可能标准化。如果没有，两个实验室之间的早期沟通和接收实验室在方法评估期间的早期参与以及进行良好的风险评估至关重要。简言之，对于基于MS的方法，在风险评估期间，仪器变量应是首要关注的。

4.2 案例研究5：不同供应商的质谱仪之间的方法转移。

在将限度测试LC/MS方法转移至生产QC实验室期间，由于两个实验室之间的仪器差异，遇到了挑战。原始方法使用配位离子喷雾电离来提高中性分析物的电离效率。分析物在C18 RP HPLC色谱柱上进行分离，用醋酸钾水溶液（0.1mmol/L）和乙腈的混合物进行洗脱，并在安捷伦MSD单四极仪器上通过SIM在m/z 260[M+K]⁺处进行监测。该方法在原始实验室中表现出了优异的性能，在0.4ppm的目标测试浓度下，S/N为23。然而，在QC实验室中，使用Waters ZQ单四极仪器无法检测到该浓度的分析物。可能是由于仪器设计的差异，Waters ZQ仪器没有以相同的方式处理微量钾盐；因此，对该方法进行了彻底改变。根据方法评估期间获得的知识，选择铵作为替代配位离子。以乙腈和甲醇为有机流动相，优化了铵缓冲液的浓度。最终，开发出一种可以在两个实验室中进行类似操作的方法。最终的流动相选择为4mmol/L醋酸铵水溶液和甲醇。该方法随后在合同实验室进行了验证，并用于支持批量生产和NDA申报。

在进行基于MS的方法期间，应通过系统适用性测试仔细监测和控制日常仪器稳定性。电离是质谱分析中的一个关键步骤，可能会受到样品和流动相中组分的干扰^[28]。在方法验证之前，必须将离子的抑制（或增强）研究彻底^[29,30]。测试多批样品应有助于考虑各种样品的潜在离子抑制。离子抑制也可能是由仪器污染引起，通过将不需要的干扰峰（例如API）转移到废物流中，而不是转移到质谱仪中，可以将仪器污染降至最低。这需要分析物和干扰峰之间有足够的分离度，以便仅由分析物峰组成的小部分进入MS。因此，一致的保留时间是该方法的一个重要属性，为确保需要的峰在检测窗口内洗脱，该方法应足够稳定，并能容忍HPLC条件的微小变化，如初始%B。由于用于开发该方法的QbD过程，以及由此产生的对方法变量和方法性能之间关系的理解，参数的微小修改不应要求重新验证。这一概念已经被GC/MS仪器的保留时间锁定技术所采用^[31]，通过改变仪器参数，使用锁定化合物保持分析物的保留时间恒定。还应评估在不影响仪器性能的情况下可连续分析的最大批次数；即在常规分析中，应控制分析序列的长度，以确保方法的稳定性和准确性，尤其是在使用直接液体进样GC/MS和大量进样时^[17]。

4.3 案例研究6：由序列内的仪器污染引起的仪器响应不稳定。

基因毒性杂质是原料药的降解产物，为此开发了基于MS的分析方法，以确定其在药品（片剂配方）中的含量。在连续进样九个样品后，发生了严重的离子抑制，与相同序列内的初始值相比，峰面积损失了三分之一。清洁电离源后，MS信号恢复。有此认为，大量的原料药和辅料近入质谱仪会导致质谱信号恶化。因此，通过简单地将不需要的LC流出物转移到废物中并缩小数据收集窗口，最终解决了信号丢失问题。

05

最终的方法验证

此时，已经建立了方法参数和方法属性之间的关系。在方法设计、评估和风险评估期间，已识别并理解关键方法风险，并在稳定性和耐用性研究期间进行了彻底调查。提出了该方法的性能控制策略。最终的方法验证是为了进一步验证方法中内置的方法性能，并进一步了解该方法。可以预见，该方法在现阶段的最终验证将是成功的。

验证的范围应取决于方法的目的。例如，对于打算转移到生产现场的方法，应进行全面验证，而对于研究方法，则需要进行有限的验证。全面验证可能包括专属性、灵敏度、线性、精密度（标准品、样品、中间精密度）、准确度（加标回收率）和稳定性。验证还将满足监管机构的当前要求，并应遵循ICH指南。限度测试和定量方法需要不同程度的验证；例如，ICH指南仅要求进行限值测试方法的专属性和检测限，而建议定量方法则需要进行全面验证^[15]。

06

结论

制定了一种在微量水平上分析药物中基因毒性杂质的方法开发策略。系统方法从预先明确的方法目标开始，通过风险评估确定关键方法变量，然后进行稳定性和耐用性研究强化度方法的理解。这反过来又允许确定关键方法参数和方法性能控制策略的可接受范围。因此，基于良好的科学理解和风险缓解方法，方法性能被构建到方法中。

建议的通用方法评估和选择流程图可作为大多数基因毒性杂质类的参考。该流程图主要基于我们实验室的实际经验，并基于常见基因毒性杂质分析物的物理化学性质。首先要充分了解分析物的稳定性和挥发性，这是任何方法开发的关键点。这将导致对三个单元操作的单独评估，包括样品制备、分离和检测，然后在预定义的方法目标的背景下进行整体评估。通过遵循建议的过程，开发出灵敏度和选择性良好的基因毒性杂质方法的成功率大大提高。由于基因毒性杂质分析方法通常比较复杂，因此更好地理解方法的可变性至关重要。简而言之，通过遵循QbD原则，可以开发一种基于科学和风险的控制策略，以确保基因毒性杂质方法更加稳定。

尽管如此，基因毒性杂质方法仍应纳入药物开发阶段。对于早期阶段的项目，只要对相对复杂的方法（例如衍生化或基于MS的方法）有良好的方法理解，就应考虑使用验证项较少的“适合目的”方法。另一方面，对于后期项目，设计QbD杂质控制过程策略应先于开发QbD分析方法，因为在QbD模板中，产品质量控制应尽可能向上游转移，以减少或消除在最终产品里的测试。

参考文献：

[1]Friscia,O.; Pulci, R.; Fassio, F.; Comelli, R. J.EnViron.Pathol. 1994,13,89.

[2]Guidelineon the Limits of Genotoxic Impurities,CPMP/SWP/5199/02, EMEA/CHMP/QWP/251344/2006; Committee forMedicinalProducts (CHMP), European Medicines Agency (EMEA): London,28June 2006.

[3]Genotoxicand Carcinogenic Impurities in Drug Substances and Products:Recommended Approaches; U.S. Department of Health and Human Services,Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research(CDER): Silver Spring,MD,U.S.A.,December 2008;

http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidance-ComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm079235.pdf.

[4]David,F.; Jacq, K.; Vanhoenacker, G.; Sandra, P.; Baker, A. LCGCEur. 2009,22,552.

[5]Liu,D. Q.; Sun, M.; Kord, A. S. J.Pharm. Biomed. Anal. 2010,51,999.

[6]Yuabova,Z. Y.; Holschlag, D. R.; Rodriguez, S. A.; Qin, C.; Papov,V. V.; Qiu,F.; McCaffrey, J. F.; Norwood, D. L. J.Liq. Chromatogr.Relat. Technol. 2008,31,2318.

[7]InternationalConference on Harmonisation (ICH) Guidance forIndustry:Pharmaceutical DeVelopmentQ8,(R2); U.S. Department of Health andHuman Services, Food and DrugAdministration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER):Rockville, MD, Aug, 2009,

http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm128028.htm.

[8]InternationalConference on Harmonisation (ICH) Guidelines, Q9:Quality RiskManagement, Nov. International Conference on Harmonisation(ICH)Guidance for Industry: Quality Risk Management Q9; U.S. Department ofHealth and Human Services, Food and Drug Administration, Center forDrug Evaluation and Research (CDER):Rockville, MD, Nov, 2005,

http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm128050.htm.

[9]Borman,P.; Chatfield, M.; Nethercote, P.; Thompson, D.; Truman,K. Pharm.Technol. 2007,31,142.

[10]Yu, L. X. Pharm. Res. 2008, 25, 781.

[11]Li,Y.; Terfloth, G. J.; Kord, A. S. Am.Pharm. ReV.2009,12,87.

[12]Zhou,L.; Socha, J. M.; Vogt, F. G.; Chen, S.; Kord, A. S. Am.Pharm.ReV.2010,13,74.

[13]Borman,P. J.; Chatfield, M. J.; Crowley, E. L.; Eckers, C.; Elder,D. P.;Francey, S. W.; Laures, A. M. F.; Wolff, J. C. J.Pharm. Biomed.Anal. 2008,48,1082.

[14]Liu,D. Q.; Chen, T. K.; McGuire, M. A.; Kord, A. S. J.Pharm.Biomed. Anal. 2009,50,144.

[15]International Conference onHarmonisation (ICH) Guidelines, Q2(R1):

[16]An,J.; Sun, M.; Bai, L.; Chen, T.; Liu, D. Q.; Kord, A. J.Pharm.Biomed. Anal. 2008,48,1006.

[17]Sun,M.; Bai, L.; Terfloth, G. J.; Liu, D. Q.; Kord, A. S. J.Pharm.Biomed. Anal. 2010,52,30.

[18]Zheng,J.; Pritts, W. A.; Zhang, S.; Wittenberger, S. J.Pharm. Biomed.Anal. 2009,50,1054.

[19]Bai,L.; Sun, M.; An, J.; Liu, D. Q.; Chen, T. K.; Kord, A. S.J.Chromatogr., A 2010,1217,302.

[20]Vanhoenacker,G.; Dumont, E.; David, F.; Baker, A.; Sandra, P.J.Chromatogr., A 2009,1216,3563.

[21]David,F.; Jacq, K.; Sandra, P.; Baker, A.; Klee, M. S. Anal.Bioanal.Chem. 2010,396,1291.

[22]Sun, M.; Bai, L.; Liu, D. Q. J. Pharm. Biomed. Anal. 2009,49, 529.

[23]Elder,D. P.; Teasdale, A.; Lipczynski, A. M. J.Pharm. Biomed. Anal.2008,46,1.

[24]Jacq,K.; Delaney, E.; Teasdale, A.; Eyley, S.; Taylor-Worth,K.;Lipczynski, A.; Reif, V. D.; Elder, D. P.; Facchine, K. L.; Golec,S.;Oestrich, R. S.; Sandra, P.; David, F. J.Pharm. Biomed. Anal. 2008,48,1339.

[25]Boyd,R. K.; Basic, C.; Bethem, R. A. TraceQuantitatiVeAnalysis by Mass Spectrometry;Wiley: Chippenham, 2008.

[26]Baldwin,R.; Bethem, R. A.; Boyd, R. K.; Budde, W. L.; Cairns, T.;Gibbons, R.D.; Henion, J. D.; Kaiser, M. A.; Lewis, D. L.; Matusik,J. E.; Sphon,J. A.; Stephany, R. W.; Trubey, R. K. J.Am. Soc. Mass Spectrom. 1997,8,1180.

[27]Zhurkovich, I. K.; Mil’man,B. L. J. Anal. Chem. 2009,64,986.

[28]Jessome,L. L.; Volmer, D. A. LCGCNorth Am. 2006,24,498.

[29]USFDA, Guidance for Industry, bioanalytical Method Validation, May2001.

[30]VanEeckhaut, A.; Lanckmans, K.; Sarre, S.; Smolders, I.; Michotte,Y. J.Chromatogr., B 2009,877,2198.

[31]Etxebarria, N.; Zuloaga, O.;Olivares, M.; Bartolome, L. J.; Navarro,P. J. Chromatogr., A 2009,1216, 1624.