ACD/Labs
本文内容是2022年3月-4月同写意系统化分析方法开发系列网络培训的第一节的部分内容。应听众的要求，我们将把此次系列演说的内容以文字的形式重现，以期令更多的读者可以有更深入的学习和讨论的机会。
今天给各位带来的内容分两部分。首先是讲一个液相方法在实验室里重现出现问题最终加以解决的案例，其次为大家介绍一下如何使用ACD开发的软件AutoChrom online 来进行基于AQbD理念的液相方法开发的流程。
故事的背景是在某仿制药的原料药有关物质分析方法开发过程中，采用原料药粗品加若干种杂质对照品混合溶液；采用色谱理论指导下的经过筛选和单因素调整方式，在Agilent1260四元泵确定了关键色谱条件：高氯酸钠溶液体系、水相pH值1.5，有机相为乙腈，使用梯度方法洗脱。从典型谱图来看，有关物质数量较多，分离达到了要求。实验室内采用了LabSolution CDS，采集的谱图以LabSolution工作站抓图形式提供。
由于研发分析实验室和QC实验室中配置的仪器主要是岛津品牌，考虑到后续的方法验证和转移工作需要在岛津液相上完成，因此在完成了此项有关物质分析方法开发的任务后，需要将此方法转移至岛津液相上重现，确认已建立的分析方法能否在后续的工作中正常使用。因此选择两台岛津的仪器进行测试。
配制好流动相、混合对照品溶液、API供试品溶液后，分别置两台不同摆放位置的液相同时检测。API供试品溶液和混合对照品溶液结果如上两图所示。两台型号配置完全一致的液相，在用同一批流动相运行同一梯度条件时，表现出了迥异的色谱行为：包括保留时间（约相差2.5min），不同保留时间的杂质分离度也有差异。
当前的分析方法存在着极高的耐用性风险。此原料药及其一系列有关物质，均为碱性化合物，酸性条件下有关物质发生电离，此时pH值、梯度、柱温必然会影响各组分的保留行为，进而影响分离度。但在方法开发阶段采用的单因素调整策略，无法关联与各组分保留行为相关的色谱条件。
虽然在进行风险分析表格里，由于使用了同一批次配置的流动相，流动相的pH差异的风险被认定为低，然而对于离子化的化合物，pH永远是绕不开的控制性因素。
根据响应曲面实验设计的原理，进行了pH，梯度，温度三因素、三水平的DoE试验（正交实验），实验设计方案见上表。
进行实验的仪器并不是在有问题的岛津仪器上执行的，而是回到了Agilent1260上进行研究。由于设计空间够宽，因此对于因素对于保留以及分离的影响的认识就更为深刻，可以明确知道关键Pair的控制性因素为何。
先看第一个模型，这是两因素的pH-梯度模型。模型提示：原方法pH 1.5 处于耐用性的边界上，pH如能调低pH抗扰动的能力会增强，梯度不是控制性的因素，梯度时间的长短不会带来根本性的峰交换和分离度下降。
再看第二个模型，这是两因素的柱温-梯度模型。模型提示：原方法温度30度，也处于耐用性的边界上，温度如能调低，其抗扰动的能力会增强，梯度不是控制性的因素，梯度时间的长短不会带来分离度下降的风险。
根据两个两因素响应面模型获取的知识，决定将水相的pH调低到1.2,色谱柱柱温调低到25摄氏度并保持原有梯度保持不变。
将新的方法条件，重新在两台测试仪器上进行测试时，两台仪器的谱图重现性变好，物质的分离度也都达到要求。
显然，通过将色谱方法调整到分离度良好的高耐用区间后，方法的质量提高了，它抗干扰的能力获得了提高。
构建一个响应面模型的流程并不复杂，首先是研究的策略：基于已有的知识空间，对关键性的因素做预判和选择，进行部分因子设计，将设计在色谱仪器上执行。收集执行后的谱图，对谱图进行处理，进行自动化或者手动化的峰匹配，提取有用的信息，包括保留时间以及各个色谱峰的形态信息。然后使用预先定义好的模型进行响应面模型的构建，然后在响应面模型内找到最好的可用方法，对这个方法进行运行确认，并与预测结果进行比较。
借助以上的流程描述，显然大家可以看到在液相方法开发中的响应面设计的考虑的因素包括pH，梯度和温度等连续变化的因子，其响应可以是整体的分离度情况，以及关键Pair的分离度情况。最终建立的数学模型能够考虑因素和因素之间的相互影响，找到最优结果时同时找到方法的耐用性边界。
在这个案例说明原先方法的质量存在明显的耐用性瑕疵，在两台很相近仪器上都发生重现性的问题。我们没有就事论事的直接在两台岛津的液相色谱上分别设计实验去锁定两者的差异，而是倒回到了原始的开发的仪器上对方法本身的质量进行探究，结果顺利解决了重现性问题。可见分析方法开发的确需要严密的设计，充分考虑因素间的影响，才能获得一个高质量的可用的方法。
在方法开发阶段，分析方法性能的变化取决于分析方法参数的变化；而分析方法参数的变化需要由分析仪器实现。因此研发人员不仅需要针对“可见”的方法参数变化进行相应的研究（分析方法开发）；在分析方法验证前，还需要针对“看不见”的仪器参数变化（不同仪器间的差异）进行考察，即使型号完全“一样”的设备，也可能会引入某些未知的重现性风险，应在差异度足够的系统上测试已经开发完毕的方法，以确保耐用性。
通过开发阶段的DOE并构建数学模型，可以获取方法的知识空间，并充分理解各因素之间的交互作用。从一台仪器上构建的模型的知识空间的应用范围，可以延伸至其他的仪器上使用，降低分析方法在其生命周期内的重现性风险。
在以上的例子里，我们使用了软件对设计空间里的几个因素进行了研究，从而解决了方法重现的问题，接下来我们讨论一下如何软硬件结合将液相方法相关的因素进行研究的自动化在安捷伦的多功能方法开发系统相结合。
在一个分析QbD的流程中，分析方法本身是一个产品。因此首先要进行分析目标的识别，理解方法所要达到的精确度和准确度等要求，然后选取合适的分析方法方向，针对这个方向进行相关的知识准备和风险分析，例如利用信息学的工具研究已知物质的结构和理化特性，尽量增加知识空间的广度，识别其中的风险。然后进入到图示为绿圈的实验室研究阶段，进行各个影响因素的研究。事实上因素的影响的能力各不相同而且还互相关联，因此有必要进行多因素同时考察，应当在知识空间之内，用必要的DoE手段，确定产品-一个分析方法的各个可用参数以及其可靠的边界范围。方法产生后，即可交付使用，但随着被检查对象的情况变化，方法随时都会被挑战，因此应根据实际情况不断调整和优化，甚至重新开发，进入一个新的循环。
在风险分析阶段，ACD提供了很强大的信息学的工具，帮助用户进行物质的性质的研究，进行色谱柱的比较和选择等等。在此基础上进行参数的研究时，就能够规避落入失败空间，令各个参数都在合理的范围内。
我们对设计空间部分进行展开讨论。在初步测试，灵敏度达到要求的情况下，液相方法的方法开发的主要任务就是基于实际情况对研究对象进行保留以及分离研究。如果要分离的对象数量众多而且较为复杂，则应主动将众多因素进行分段研究。通常主动将研究过程分为筛选阶段和优化阶段。在筛选阶段，应对色谱柱，强洗脱流动相种类，弱洗脱流动相种类等进行筛选，而在优化阶段则进行pH,混合流动相，梯度，温度，盐浓度以及流速的研究。不是所有的方法开发都需要完成如此众多的因素的研究。比如如果研究的有关物质只有寥寥数个，分离难度低且风险低，方法本身又用于CMC前期研究，那这个分段研究可以大大简化，进行快速筛选和简单优化即可。而如果方法研究的有关物质众多，方法产品将服务于生产，则应进行明确的分阶段研究，要秉承的原则之一是在筛选没有完备之前，不轻易进行优化。此外，在方法开发完毕后，应对方法抵抗外界干扰的能力进行测试，进行耐用性验证。接下来，我们就介绍一下用ACD/AutoChrom online 如何控制安捷伦的多功能方法开发的硬件系统进行分段的研究。ACD的AutoChrom是一种专门设计的AQbD类软件。它的一部分重要功能就是基于知识空间以及要求，制定方法开发的策略，然后驱动具备多流路和多柱能力的方法开发硬件系统进行自动化的系统化的研究。
我们先介绍一下筛选阶段的流程。通常在这个阶段应当选择对于保留因子k和分离选择性影响最大的因素进行研究。对于反相方法来说，通常就是选择色谱柱，pH和有机相的种类。基于知识空间做掌握的信息对这些因素的取样做合理的设计，例如色谱柱的空间差异性应充足，pH的研究范围应当合理，如有可能能尽量在缓冲盐的缓冲范围，需方便接入质谱进行定性时应使用挥发性的缓冲体系，有机相的种类在初始阶段首选甲醇和乙腈。由于安捷伦的多功能方法开发系统支持多流路和多柱，对选择的因素进行全面实验。这个策略制定好之后，在AutoChrom软件内配置好硬件系统上做挂载的色谱柱和流动相信息后，软件就形成了一个工作序列交由Chemstation来完成。一致在等待任务的Chemstation工作站接到指令后，按照顺序完成筛选实验，数据生成后将自动被抓回到AutoChrom软件内。软件会对收到的筛选数据进行自动化的标峰，必要时进行辅助化的峰匹配，它会对筛选结果进行排序。此时研究的主要目标时择取最优结果，这个最优结果需要：主峰峰形好，主峰附近尽量无干扰，已知杂质都被找到且保留因子较为合适，分离度可以不足，但关键pair有可分离的趋势。根据以上的原则，将最优的一个或者两个结果挑选出来，作为后面优化实验的起点。如果筛选的结果都不令人满意，则应重新进行筛选。
选择了可供优化的起点，接下来便是进行因素的选择。最简单的优化是进行梯度优化。基于Q14多因素研究的要求，通常推荐进行梯度和温度的优化，或者更高维度的三因素的优化。此时的实验设计的方法依然是部分因子设计的全面实验。将AutoChrom生成的工作序列推送给仪器后，仪器自动完成工作任务，生成数据，数据被抓回到AutoChrom软件内。对抓取的数据进行自动以及手动的处理后，就需要基于信息构建响应面模型，寻找到满足条件的最优结果，确定中心点。将中心点的条件，在仪器上进行运行，确认模型的有效性和可靠性，完成初步的优化。至此，方法开发的流程顺利的话，整个运行时间由于工作逻辑清晰，流程合理，自动化功能加持，整个开发的时间大大降低。而此方法本身至少对5个因素进行了最优研究，耐用性有很好的保证。当然，如果对方法的可靠性和抗微扰的能力有进一步的确认需求，则应进行耐用性验证实验。
传统的耐用性研究是在中心点选定后，固定其他因素，只变动一个因素的水平来考察其对结果的影响。这种实验设计方法无法发现多个因素同时发生微扰时的风险。AutoChrom里内置有Plakett-Burman设计方法，可以对7-8个以上的考察点进行同时考察，实验数量则仅为十几个。经过统计学软件的分析后，可以识别出对方法耐用性挑战最大的因素是什么，以便于调整中心点，或者进一步进行优化。
感谢大家关注，以上即为此次演讲的主要内容。我的同事陈诚对此次演讲的内容贡献很多，在这里表示感谢。欢迎大家与我们联络讨论AQbD相关话题，很愿意与诸位交流思想。
——by 阎作伟
首页
