超氧化物岐化酶(SOD)的应用方案(三氮蓝四唑NBT法测定)
01引言
SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD:Mn-SOD和Cu.Zn-SOD，它们都催化下列反应:由于超氧自由基(02)为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子02-..-，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲躜(黄色)，继而还原生成二甲躜，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H结合生成H2O2和02，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲攒生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照--定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。
02
仪器与试剂
美析UL-1000超微量紫外可见分光光度计
离心机
0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8):
A母液: 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4 12H20(分子量358.14)71.7g; B 母液: 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液:取NaH2PO4 12H2O (分子量156.01) 31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。
0.05mol/L PBS ( pH7.8)的配制:分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml,
B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。
14.5mM甲硫氨酸溶液:称取1.0818g Met用磷酸缓冲液(pH7.8)定容至500ml。
3mM EDTA-Na2溶液:称取0.1117g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。
60μM核黄素溶液:称取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。
2.25mM氮蓝四唑(NBT)溶液:称取0.092g NBT用PBS定容至50ml,避光保存。
03
实验步骤
1.酶液提取
称取0.5g (可视情况调整)样品(新鲜叶片或根系)洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入10ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7.8) 在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4C、12000g 下离心20min，.上清液即为SOD粗提液。
2.酶活性测定
(1)反应混合液配制(以60个样为准):分别取配好的Met溶液162ml,.EDTA-Na2溶液6ml，NBT 溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后充分摇匀;
(2)分别取2.9ml反应混合液和0.1ml (可视情况调整)酶液于指形管中此即反应管;同时做两支对照管，其中1支试管加2.9ml反应混合液和0.1ml PBS (不加酶液)作为最大光还原管，另1支加2.9ml反应混合液和0.1mlPBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。
(3)将试管置于光照培养箱中在4000lux光照25°C下反应20min;
(4)反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度(OD560 )
04
计算结果
已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一-个酶活单位(U),
按下式计算活性n=[(ODmax 0D560)/0Dmax]/2
SOD总活性= [( Ack-AE)XV]/ (1/2AckXWXVt)
SOD比活力=SOD总活性/蛋白质含量
SOD总活性以鲜重酶单位每克表示(u/gFW);比活力单位以酶单位每:毫克蛋白表示;
Ack 为照光对照管的吸光度;
AE为样品管的吸光度;
V为样品液总体积(ml);
Vt为测定时的酶液用量(ml); W为样品鲜重(g);
蛋白质含量单位为mg/g。
05
注意事项
1.酶液提取须在4℃下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降;
2.植物中的酚类物质对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或pvpp等，尽可能除去植物组织中的酚类等次生物质。
3.NBT反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。
4.加反应液时最好在暗光下进行;
5.核黄素产生02，NBT还原为蓝甲躜都与光照密切相关，照光强度和时间要严格控制。光照培养箱内壁裱糊锡箔纸，使箱内均匀光照约达40μ molms，同时使照光时间一一样，选择试管尽量- -致，照光结束后测-一个拿一个(最好晚.上做) (温度高时照光时间缩短，温度低时延长);
6.测定活性时加入的酶量，以能抑制反应的50%为佳。(一个酶单位相当于引起反应液达到半抑制时酶的用量,即以能抑制反应50%的酶量为一个SOD酶活性单位。)(反应液中加酶液与PBS调零差异不大，反应液调零与其它两个则有一定差异。)
06
仪器特点
UL-1000超微量紫外可见分光光度计
1．产品简介
超微量紫外可见分光光度计是一类很重要的分析仪器 ,无论在物理学、化学、生物学、医学、材料学、环境科学等科学研究领域 ,还是在化工、医药、环境检测、冶金等现代生产与管理部门 ,超微量紫外可见分光光度计都有广泛而重要的应用。超微量紫外可见分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器，常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。超微量紫外可见分光光度计已成为现代分子生物实验室常规仪器。
2．仪器特点
*检测所需样微量，最低只需0.5ul
*检测范围宽，比传统的分光光度计的上限高100倍
*对于多数样品而言，无需稀释
*机器无需预热，直接测量，无需检测容器，日常消耗低
*全波长190-1100nm，分辨率1nm，仪器都自动给出全波长的扫描结果190-850nm
*体积小巧，便携式包装，满足现场检测的需求
*通过PC控制实现更精确和灵活的测量
3．技术指标
*最小样本量：0.5μl
*光程：1mm/0.2mm
*波长范围：190～850nm
*波长精度：1 nm
*波长分辨率：≤0.3nm（FWHM 在 Hg 253.7nm）
*吸光率精度：2%（0.76 在 257nm）
*吸光率分辨精度：0.002Abs（1mm 光程）
*吸光率范围：0.02～300 (等效10mm光程)
*可准确测量范围：0.1～5 Abs. ±0.1Abs 5～80 Abs. ±2%
*侦测器：3648像素线性CCD阵列
*光源：微型氙气闪光灯系统
*测量时间：<5 秒
*尺寸：200mm×130mm×136mm（L×W×H）
*重量：≤ 2.0kg
*样本检测平台材质：304 不锈钢和石英
*输入电压：AC100～240V 50-60Hz
*操作电源功率：24W
07
关于美析
上海美析仪器有限公司(以下简称美析)，是一家具有自主知识产权的高新技术企业，美析的创业理念“科技——因你改变”，并以此为企业宗旨，不断探究、果敢创新。特别是在分析测试仪器领域，不断开发出先进的产品，使美析成为优质仪器资源的供应者。
美析主营光谱类仪器：可见分光光度计、紫外可见分光光度计、原子吸收光谱仪、原子荧光光度计、ICP-AES、ICP-MS，生命科学仪器：超微量分光光度计、全自动核酸提取仪，目前，我们的产品已广泛应用于有机化学、无机化学、生物化学、医药、环保、冶金、石油、农业等领域。同时美析利用在产品机械结构、光学设计、电气应用和软件开发方面积累的丰富经验，结合市场的最新实际需求，近期将陆续推出一批全新的分析类仪器。
首页
