背景资料
国内一家药物研发企业在研究由2-氯-D-苯丙氨酸合成二氢吲哚-2-羧酸的过程中，发现在反应产物中存在一较大含量的未知结构杂质，二氢吲哚-2-羧酸合成反应方程式如图1。经LC-MS测试后，分子量大致为目标产物的两倍。结合反应机理和起始物料结构，合成工艺人员推测该未知杂质可能为两分子起始物料之间结合，两分子间发生了取代反应，生成的未知杂质结构对称如图2所示。
图1 二氢吲哚-2-羧酸合成反应方程式
图2 合成工艺人员所推测目标杂质结构
通过柱层析的分离方法富集到HPLC纯度为80%左右的目标杂质（HPLC谱图如图3所示），同时采集了富集所得的目标杂质的NMR碳谱（碳谱谱图如图4所示）。在验证碳谱和推测结构吻合度的时候，发现推测结构与NMR碳谱不符：一，推测的结构为对称结构对称NMR谱图应该相对简单但是实际NMR碳谱谱峰的个数明显偏多；二，在NMR碳谱上化学位移170ppm左右（通常为羰基信号）存在两个信号，这也与推测的对称结构不符。
图3 富集所得目标杂质HPLC测试图
图4 目标杂质碳谱谱
为了弄清楚未知杂质的结构，此项目交由长沙晨辰药物科技有限公司进行进一步研究。由客户图3及图4可知，原先目标杂质纯度较差，为了得纯度不低于95%杂质对照品降低NMR结构鉴定难度，长沙晨辰医药科技有限公司采用制备液相对目标杂质进行进一步分离纯化。目标杂质经制备液相纯化后的HPLC测试图如图5所示，纯度为97.80%。同时采集纯化后样品的NMR碳谱，与纯化前相比杂峰明显减少，这对准确鉴定杂质结构非常有意义，排除了NMR谱图上杂信号的干扰。
图5 目标杂质经制备液相纯化后的HPLC和NMR谱图
杂质结构鉴定
采集分离纯化后杂质样品的高分辨质谱和NMR一维谱及二维谱（COSY、HSQC-DEPT和HMBC）谱图后。将谱图在ACD NMR Workbook软件中打开，查看其HSQC-DEPT谱图发现，其信号基本上还是成对出现，但是成对出现的信号两者间氢碳化学位移存在一定的差异，如CH两信号（H3.72，C53.24）（H4.82，C69.45），通常此位置CH为连杂原子N的信号，进一步证明目标杂质结构为非对称结构。
图6 目标杂质的HSQ-CDEPT谱图
目标杂质结构重新推测
结合上述分析结果，重新考虑目标杂质的结构。一分子2-氯-D-苯丙氨酸生成了二氢吲哚-2-羧酸后与另外一分子2-氯-D-苯丙氨酸进一步发生了分子间取代反应，生成的产物结构以及反应途径如下：
图7 推测的目标杂质结构及其反应路径
接下来将重新推测的结构导入ACD NMR Workbook中，对其NMR信号和结构之间进行准确归属验证，发现化学位移以及所有的NMR信号均与结构相符。
图8 在ACD NMR Workbook中结构与HMBC信号归属后的结果
从归属的结果可以看到，结构上所有的连接线（HMBC和COSY）信号均没有问题，同时结构上用不同色块标示碳谱化学检查结果，ACD NMR Workbook在归属时会自动比对实验谱和标准谱图，如果碳谱的化学位移偏差小于3ppm则在结构上该原子用绿色色块标示，如果偏差在3-10ppm之间，该原子会使用黄色标记。该结构的归属质量检查大部分为绿色标记，这证明化学位移检查没有太多的问题。这里需要特别关注的两个连N的CH归属情况，2号位C化学位移为69.45ppm，19号位为53.24ppm，为何2号位化学位移比19号位低场？这是因为1号位N（结构上缺省）上孤对电子向两侧苯环p→π共轭，这大大降低了N上的电子云密度，进而降低了2号位碳上的电子云密度，使得2号位碳更偏向低场，而20号位N不存在此效应，所以相对于2号位碳19号位碳的化学位移要偏高场。
综合反应机理和NMR谱图解析结果，最终我们将目标杂质的结果重新修正为：
图9 重新修正经NMR谱图验证后的目标杂质结构
阎作伟的Comments
NMR Workbook Suite 是ACD Labs 开发的针对小分子结构确证工作的效率工具，能够成倍的提高团队核磁专家的生产力。而且NMR Workbook Suite是ACD Structure Elucidator Suite从头结构解析软件的基础，因此在最近我们筹备进行的制药企业核磁之星计划中也选用了NMR Workbook Suite 作为培训工具。希望医药企业的核磁工作专家和爱好者踊跃参与。报名链接到2022年7月18日关闭（
首页
