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一步一步为您解密SNaPshot：从实验设计到数据分析（下）

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2020.1.17
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赛默飞世尔科技生命科学产品

上篇文章中，详细地介绍了SNaPshot实验的引物设计以及预实验的第一和第二部分（SNP位点逐个验证的流程），那我们接着来看第三部分，多重实验测试。    

   

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单个位点逐个验证完成后，就可以安排测试多重实验了。该步骤要分两步走：第一步，多重SNaPshot反应；第二步，从PCR扩增开始多重反应。


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该步骤实际上是把多个位点的单重PCR产物混合在一起，然后做多重的SNaPshot反应，检测SNP位点，与上述单个位点的结果做对比，检测是单引物混合前后的结果是否一致。

  1. 从“第一部分 得到每个位点的SNaPshot结果”这步的纯化产物开始，把产物可以按照1:1混匀

  2. SNaPshot 反应单

    单碱基延伸引物混合策略：每个引物在引物混合物中的终浓度推荐为0.2µM。引物终浓度范围可控制在0.05-1.0 µM。反应体系配制以及反应条件都与上述一致

  3. SNaPshot反应产物纯化以及上机与“第一部分 得到每个位点的SNaPshot结果”一致

  4. 得到结果与“第一部分 得到每个位点的SNaPshot结果”得到SNaPshot 结果对比，对比同样样本的相同SNP位点的分型结果，片段大小位置是否一致

     

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该步骤采用的PCR扩增试剂与之前不一样啦，这里要做多重扩增，就需要能够做多重扩增的酶支持。推荐Platinum® Multiplex PCR Master Mix。

  1. 反应体系     

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    注：详细请参见“User Guide：Platinum™ Multiplex PCR Master Mix”

  2. 反应条件设置

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    注：[1] 此酶延伸速率为60sec/kb，可以根据扩增片段大小设置

  3. 后续步骤与上述一致

  4. 与“第一步 多重SNaPshot反应测试”得到结果对比，是否一致，如果每个SNP位点大小和碱基都match，没有干扰结果判断的杂峰（如图8所示）。恭喜您！预实验到这里可以结束啦！

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    图8 多重SNaPshot反应结果与单重结果对比

    注：以4个位点为示例，上图从上往下，前四个为同一个样本的单个SNP位点的SNaPshot结果，最后一个为同一个样本，四个SNP位点的多重SNaPshot检测的结果，峰的颜色（也就是碱基）和对应的片段大小位置一致，说明多重和单重的结果一致。

  5. 微调，让结果更加漂亮

最后确定SNaPshot峰形图可参考下图9，所有SNP峰高度相差不大，看起来美观整齐。如果发现有的位点的峰明显低于其他的峰（例如低于30%）。可以先试着增加SNaPshot反应中该（峰高较低的）引物的用量（或者降低峰高的引物用量），如果效果不明显，再试着增加多重PCR反应这一步该SNP对应引物的用量（或者降低峰高的SNP引物的用量）。

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图9 较理想的SNaPshot实验结果图示


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使用预实验已经摸索好的实验体系和反应条件，把您所有的样本实验完即可。请在实验中添加阴性对照，检验实验过程或者体系中是否存在污染。


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使用GeneMapper软件对数据进行分析得到SNP基因型，实际上就是Panel和Bin的设置问题。这一步也可以在预实验中完成。

下面通过视频，以GeneMapper软件中示范数据向您做个介绍。示范数据查找路径：

GeneMapper软件安装的盘符: \\AppliedBiosystems\\GeneMapper\\Example Data\\SNaPshot\\SNaPshot。来跟着我一起设置吧


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SNaPshot技术可以对不同基因的不同位点同时进行检测，我们推荐单管检测10个SNP为宜。然而，针对SNaPshot技术应用细节介绍的文章不多，本文向大家详细地介绍了SNaPshot如何设计引物、准备试剂、预实验、正式实验和数据分析。

SNaPshot实验可以概括为两次PCR，两次纯化。本文着重强调了第一次的PCR采用多重PCR，因为其省时、省样本、省成本，推荐首选。相信大家可以看得出来，预实验非常关键。可以说，预实验成功了，实验设计就成功了一大半。

如若第一步PCR采用单重，就是一个靶标SNP、一个靶标SNP地扩增，然后合并纯化的PCR产物去做SNaPshot反应。这样操作很简单，快捷易上手。

数据分析是最后一道关了。设置正确的Panel和Bin是数据分析的关键，因此在设置时需要您倍加注意。多加练习和总结，相信您很快就会掌握GeneMapper软件使用技巧，快速准确得到分析结果。除此之外，建议您知晓一些信息，例如SNP位点在群体中的背景情况、SNP位点分布在哪条染色体。例如，如果分布在X染色体上的，那么XY染色体决定的男性（雄性）肯定只有纯合，没有杂合的。还有就是基因频率，某个SNP位点，在已有的研究中，某一单倍型在群体中出现频率非常高，那么在检测结果中，出现具有该单倍型的样本往往偏多。

请谨记，这篇文档仅供参考。针对您的实验，要因地制宜的哟。


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  1. You FM, Huo N, Gu YQ, Luo MC, Ma Y, Hane D, Lazo GR, Dvorak J, Anderson OD. BatchPrimer3: a high throughput web application for PCR and sequencing primer design. BMC Bioinformatics. 2008, 9:253, doi:10.1186/1471-2105-9-253 

  2. Holleley CE and Geerts PG. Multiplex Manager 1.0: a cross platform computer program that plans and optimizes multiplex PCR, BioTechniques. 2009, 46(7):511-517

  3. Protocol: ABI PRISM® SNaPshot™ Multiplex Kit

  4. User Bulletin: Generating high‑quality data using the BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Using ExoSAP-IT™ Reagent for PCR purification, Publication Number MAN0015798, Revision A.

  5. User Guide: DNA Fragment Analysis by Capillary Electrophoresis, Publication Number 4474504, Revision B.

  6. User Guide: Platinum™ Multiplex PCR Master Mix, Publication Number 4463722, Revision B.


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