Mobius® MCC-连续流层析系统——长时间稳定连续生产保证

默克工艺解决方案

2023.2.21

作者默克

TA的动态

简介

抗体药物的需求增加是生物制药行业重要的业务驱动因素，其中下游工艺 (DSP) 的成本、灵活性以及新产品推向市场的速度是行业关注重点。针对这些业务需求，生产商、行业联盟和政府机构正在研究优化下游生物工艺的策略。

欧盟“Horizon 2020”计划中的一个创新项目是“下一代生物制药下游工艺”( nextBioPharmDSP) 。该项目的目标是利用一次性技术实现完全集成的下游连续制造平台。目标是在三个主要领域满足市场需求：降低成本、提高生产效率和加快上市速度。

连续流工艺和一次性技术被提出来应对这些挑战，以提高生产力、降低资本支出和提高产品质量。通过实施一次性技术来解决工艺灵活性问题，这消除了在产品之间转移时潜在的遗留问题，并进一步降低了生物负荷风险。最后，连续流工艺和一次性技术通过将工艺放大模式变为横向放大模式，使临床批产品规模成为最终的生产规模，从而加快了上市速度，进一步消除了转移风险。

在这项研究中，评估了一次性技术和先进的分析工具。该项目的一个关键组成部分是连续捕获层析的集成。此处报告了该项目开发和应用多柱捕获 (MCC) 系统的结果。

图 1：连续捕获工艺

连续捕获工艺

在标准批次操作中，捕获柱的动态结合能力(DBC)被定义为操作过程中10%的产品被穿透(BT)。因此在生产过程中，将层析柱加载到该DBC的80-85%(大约相当于树脂利用率的60-70%) 。所有操作(上样、清洗、洗脱等) 都在一个柱子上进行，柱子通常有20厘米的床高(BH)。在这些条件下，仅柱的第一部分被使用，并且从柱的顶部到底部存在蛋白质浓度梯度。为了提高填料的使用率，该层析柱被2个串联的较小层析柱所取代。

重复之前的操作，这次不是使用1个20 cm BH的柱子，而是使用2个10 cm BH的柱子。将相同数量的蛋白质加载到串联设置的两个柱子上。在第一个柱之后监测穿透曲线。上样固定数量的产品结束后(与批次模式加载的数量相同) 可以大致达到60%的BT，这代表了大约90%的填料利用率(而不是60-70%) 。因此装载2个串联的层析柱而不是一个层析柱，可以最大限度地利用填料。

这促使了连续层析的引入，其中至少三个层析柱同时运行。如图2所示，一旦层析柱3被上样(图2a)，它就与层析柱2断开连接以进行清洗、洗脱和再生(图2b)。同时，层析柱2(已部分上样)与层析柱1串联设置，层析柱1仍未使用并准备好接受产品上样。

当层析柱1上样后，将其从层析柱1断开以进行清洗、洗脱和再生(图2c) 。对层析柱1重复相同的过程。这个完整的序列称为一个循环，可以根据需要重复处理多次料液或直到层析填料达到规定的最大循环次数。

对于固定的产品量，与分批模式(60-70%的填料利用率) 相比，串联上样的层析柱利用率更高(利用率为 90%) 。这些层析柱可以在填料的整个生命周期内循环使用，从而所需体积更小，并保持比批次模式更高的DBC。这降低了成本，同时完全保持了捕获层析纯化的性能和稳定性。

图 2：连续循环描述

系统设计

使用了默克MCC多柱捕获系统。特点包括：

全自动一次性系统

3柱操作，直径从7到25cm(每柱8到120 L/h，可放大至150 L/h)

2个区域(3个产品入口，6个溶剂入口)

Common Control Platform® 软件界面V 6.0(图3)

通过UV280 nm或其他UV检测洗脱峰

通过紫外位移检测蛋白质穿透

额外工艺参数属性的外部PAT能力

图3：Common Control Platform® 软件界面 V 6.0

测试总结

概念验证测试⸺乳清蛋白捕获

目标

评估和优化系统性能以实现24小时不间断连续运行和自动层析柱切换。

材料和方法

进行了五次运行。对于上样材料，用纯净水制备650 L乳清混合物(牛奶蛋白混合物)，沉淀后，0.2 µm过滤并上样到三个预装柱上，这些柱含有强阳离子交换Fractogel® SO–3树脂，有着10厘米BH和直径。

此概念验证在24小时内以17 L/h的流量进行了三个循环(每柱) 。

图 4：连续运行24小时的层析图

结果和结论

图4显示了24小时内三个周期内层析柱之间的定期切换，其中没有任何中断。该图显示了前三个洗脱峰的不规则性(*)；它对应于初始上样阶段，不代表连续循环(缺少预上样) 。随后是连续模式中预期的重复规则洗脱峰。

该运行展示了包括自动切换层析柱在内的24小时成功且有效的连续处理。

集成到下游连续流mAb工艺中

在终端用户处运行工艺

目标

目标是连接完整的下游工艺并连续运行，以展示成本降低、生产力提高和降低环境影响等好处。这通过使用mAb在1000 L生物反应器规模上执行四次验证运行得到证明。捕获步骤的目的还在于证明使用多柱捕获系统连续、稳健地捕获mAb的可能性。

材料和方法

1000 L生物反应器中生产的单抗，以流加模式运行。细胞培养收获物用pDADMAC® 阳离子的单抗聚合物絮凝剂预处理，并通过 Clarisolve® 40MS深层过滤器和Millipore Express® SHC除菌级过滤器进行澄清。使用多柱捕获系统以0.28 L/min的平均流速将这个澄清后蛋白连续上样到蛋白A填料 (3 x 0.55 L, 10 cm Ø x 7 cm BH) 上2.5天。洗脱液被不间断的送去病毒灭活。病毒灭活(VI)工艺在3L一次性罐中完成，它们能够连续降低pH值，将溶液停留至所需时间，并在精纯层析前重新调整pH值。然后以流穿模式对产品进行精细纯化并送至后续操作。所有连续操作均使用互连系统执行，以便在发生偏差时触发动作并发送反馈警报。这些互连如图5所示。柱后UV传感器触发了基于穿透检测的上样柱之间的切换以及洗脱峰检测期间废弃物和馏分之间的切换。在病毒灭活工艺的入口处安装了一个阀门，以根据这些罐的液位将馏分转移到一个或另一个罐中。可以发回反馈警报(例如罐超载) 以中断多柱捕获系统。灭活流程的最后一个罐的液位控制着精纯层析系统的启动。

图 5：项目运行期间的系统互连

结果和结论

通过在验证运行中优化完整DSP系统的操作参数，可以在运行后的多柱捕获系统上持续地处理千克量的mAb。我们在前3次运行期间每柱运行大约30个循环，在最后一次运行期间运行46个循环，总共146次结合/洗脱操作。表1显示了不同运行的参数和结果。

表 1：项目运行的参数和结果

验证运行的MCC性能

第四次验证运行的循环数最多，本节将回顾此结果。在此运行期间，在超过2天的时间里，对蛋白A柱进行了46个循环的连续捕获。与每根层析柱相关的UV光谱如图6a-c所示，所有三个层析柱的叠加光谱(图6d) 表明在139次结合/洗脱操作中的性能始终如一。正如在概念验证中和预期的那样，第一个周期是不规则的，然后是规则且可重现的峰。观察到一个短暂的中断(*)，与下一步骤(病毒灭活) 触发的暂停相关联，并与罐液位警报相关联。除此之外，没有观察到其他中断。

图 6a：第四次验证运行的色谱图，第1柱

图 6b：第四次验证运行的色谱图，第2柱

图 6c：第四次验证运行的色谱图，第3柱

图 6d：第四次验证运行的色谱图，第1、2和3柱

定义的BT百分比对应于杂质平台和澄清收获物的最大UV值之间的差异(图7) 。图8显示了在第四次验证运行的139个循环中，杂质平台(点)和穿透(正方形) 的紫外信号触发了连续捕获系统上的层析柱开关。在图表上，可以观察到两个趋势。圆点表示上样过程中的稳定吸光度，对应于从正在上样的层析柱中分离出来的杂质。图表上的方块代表每个循环的吸光度(产物和杂质)，并对应于达到定义的穿透时柱之间的切换值吸光度。在这个项目中，使用的开关值是BT的60%。图8显示了一个又一个循环的杂质平台和穿透检测水平的极端规律性，标准偏差低于传感器的精度(表2)，证明整个过程中不同周期的性能非常一致且具有可比性。