流式细胞术（Flow cytometry，FCM）是对悬液中的单细胞或其他颗粒，通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。作为一种新兴的生物学检测技术，由于其快速、多参数、高通量、自动化的技术优势，流式的应用领域越来越广泛，从传统的免疫学、血液学、肿瘤学等生命科学领域，到药物研发、细胞基因治疗、生物材料、海洋生物学、化妆品等领域都有广泛的应用前景。
虽然有这么多的优点，但经常做流式实验的研究人员也非常清楚，有时候流式实验结果具有一定的主观性，比如有些分群不清楚的设门、弱表达或连续表达指标的阴阳性群界限、死活细胞的区分、补偿调节合不合适等问题。
那么如何克服这么多的不确定性呢？
赛默飞全新推出了Attune Cytometric V6.0的自动图像分析功能，再也不用担心设门问题了！下面来了解一下这个全新的软件吧。
新增25个图像参数，自动分析成像结果
利用机器算法，每秒可快速分析1000张图像
将流式数据和成像结果综合分析，得到更多的生物学信息
更好地区分单个细胞、黏连体和细胞团块，进行准确设门，减少人为因素的影响
图1. 自动图像分析参数。(A) 软件可以识别目的细胞或颗粒的边界及中心点。(B) 确定待测细胞的中心点有助于确定图像中细胞或颗粒的数量。(C) 数据分析前可以利用质控功能去掉图像中视野外的目的细胞。左图为目的细胞，右图为非目的细胞。(D) 利用图像衍生参数轻松区分样本中的单个细胞、黏连细胞和细胞团块。
下面以最简单的细胞凋亡实验为例，来验证带自动成像功能的Attune CytPix成像型流式细胞仪可以进行精确设门，并减少人为因素的影响，从而得到更准确的实验结果。
材料和方法
处于对数生长期的Jurkat细胞用10 uM顺铂处理4小时诱导凋亡，用Invitrogen Alexa Fluor 488 Annexin V, PI和 Hoechst 33342进行染色后，在带Invitrogen CytKick Max自动进样器的Attune CytPix成像型流式细胞仪进行上机检测，用100 ul/分钟的流速进行上样。每个样本收集30000个细胞和7000张图像，用Attune Cytometric软件的“Cells Full Resolution”模式分析所有图像结果。
图2. 利用自动图像分析功能减少设门时的主观性。传统流式细胞仪利用散射光参数排除细胞碎片和黏连体。(A) 顺铂诱导的Jurkat细胞用Annexin V、PI和Hoechst染色。软件对所有细胞进行分析，分别圈出有核细胞和单个细胞后统计凋亡细胞的比例。 (B) 利用图像衍生参数排除细胞碎片或凋亡小体后圈出>8 um的目的细胞，设为“SizeGate”门。“ParticleCount”参数“1”附近的标记为单个细胞，然后分析“AISinglets”门内的凋亡细胞，可以清晰地区分凋亡细胞、凋亡晚期/死细胞和活细胞。
图3. 自动图像分析功能提供一致的设门策略。(A) 在Hoechst/SSC-A点图中利用图像衍生参数区分凋亡小体和有核细胞。(B) 通过自动成像分析设门工具中的直径大小参数有效区分>8 um的目的细胞。
图4. 自动图像分析功能可有效减少不同用户之间设门和后续细胞亚群分析的差异。(A) 自动图像分析功能可有效减少不同用户间设门的差异。(B) 用或不用图像分析功能分别检测“Size exclusion”和“Singlet gating”的平均变异系数。(C) 自动图像分析功能可有效减少后续亚群分析时不同用户间的差异。 (D) 用或不用图像分析功能分别分析不同凋亡细胞亚群的平均变异系数。 (E-F) 不同亚群的细胞成像结果。
最后总结一下，本文提到的这款神器——Invitrogen Attune CytPix 成像型流式细胞仪：
Attune CytPix是在Attune NxT流式细胞仪的基础上增加了明场成像功能，既保留了传统流式高速、高参数、大数据分析的优势，又增加了明场观察细胞形态、活性等信息，在生命科学研究、细胞治疗和生物技术开发等领域都有广泛的应用前景。
其主要技术优势有：
声波聚焦技术，上样速度比传统流式细胞仪快10倍
高速成像和AI自动成像功能，6000张图片/秒
专利抗堵设计，大细胞、黏细胞轻松上样
可达4激光16个参数，配置灵活，可现场升级
具备细胞绝对计数功能，同时可配置流式自动化工作站
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