五、中性粒细胞碱性磷酸酶染色
染色原理
中性粒细胞碱性磷酸酶染色的方法有Gomori钙-钻法和kaplow偶氮偶联法,因为钙-钻法操作较为繁琐且所需时间长,偶氮偶联法的试剂盒操作方便,染色时间短,故目前国内常用偶氮偶联法,下面介绍该方法的原理。
kaplow偶氮偶联法成熟中性粒细胞碱性磷酸酶(neutrophilic alkaline phosphatase, NAP)在pH
9.6左右的碱性环境中,能水解基质液中的磷酸荼钠底物,释放出荼酚,后者与重氮盐偶联,生成不溶性的有色沉淀,定位于细胞质酶活性所在之处。
试剂器材
1.10%甲醛甲醇固定液
甲醛 25mL
甲醇 75mL
混合后置4℃冰箱保存。
2.丙二醇缓冲液
(1)贮备液(0.2mol/L)
2-氨基-2甲基-1,3-丙二醇 10.5g
蒸馏水 加至50O mL
溶解后保存冰箱内。
(2)应用液(0.05mol/L,pH 9.75)
0.2mol/L贮存液 25mL
0.1mol/L盐酸 5mL
蒸馏水加至 100 rnL
3.基质孵育液(pH9.5~9.6)α-磷酸荼酚钠20mg溶于0.05mol/L丙二醇缓冲液20mL,再加坚牢紫酱GBC盐(或重氮坚牢蓝)20mg混合后用滤纸过滤,用前临时配制。
4.1g/L苏术素复染液取1g苏木素加到蒸馏水500mL中,加热煮沸,使苏木素溶解,再加入蒸馏水500mL、碘酸钠200mg、硫酸铝钾50g,充分混匀,置棕色玻璃瓶中室温保存,使用前过滤。
操作步骤
1.固定新鲜干燥的涂片用10%甲醛固定液固定30s,蒸馏水轻轻冲洗30~60s,待干。
2.显示把涂片浸入基质孵育液中,在室温下温育10~15min(冬季放孵育箱温育)。蒸馏水冲洗2min。
3.复染置苏木素复染液复染5~8min,蒸馏水冲洗1~2min,待干,镜检。
注意事顶
1.坚牢蓝等重氮盐的质量好坏是NAP染色成败的关键。
2.基质孵育液必须临用前新鲜配制。
3.所用的片子要新鲜。固定后,一般在一周内进行染色。做NAP染色时,最好选择其他患者的片子做阳性对照。
4.NAP染色以阳性率及积分报告结果。
实验评价
1.本法较钙-钻法简便、快速,色彩鲜艳,结果准确。
2.临床上NAP染色应用较广泛,但受主观因素影响较大,因此参考值变化较大。所以,NAP积分明显增高或明显减低者才有临床意义,同时要排除生理性影响(如年龄、性别、应激状态、月经周期、妊娠及分娩等)。
六、铁染色
染色原理
正常人骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中。骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用,形成普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀,定位于含铁的部位。
试剂器材
1.酸性亚铁氰化钾溶液
200g/L亚铁氰化钾溶液 5份
浓盐酸 1份
取200g/L亚铁氰化钾溶液置于试管中,缓缓滴加浓盐酸,边滴边摇匀,待烟雾消失后,过滤备用。
2.2g/L核固红-硫酸铝溶液,取硫酸铝2g溶于100mL蒸馏水中,再加入核固红0.2g。置37℃水浴中1h并随时振荡使其溶解,过滤后备用。
操作步骤
1.固定干燥骨髓涂片用甲醇固定10min,待干。
2.显示玻片上滴满酸性亚铁氰化钾,37℃染色30min蒸馏水冲洗。
3.复染置核固红液染10~15min。流水冲洗,待干,镜检。
注意事顶
1.玻片需经去铁处理将新玻片用清洁液浸泡24h,取出后反复水洗,浸入95%乙醇中24h,晾干,再浸泡在5%盐酸中24h,用双蒸气反复浸洗玻片,取出烤干后备用。
2.骨髓取材要满意,做细胞外铁时一定要有骨髓碎块或颗粒,取材不佳时,往往影响结果判断。
3.酸性亚铁氰化钾溶液须新鲜配制。
实验评价
1.铁染色是检查骨髓中贮存铁最简便有效的方法,此结果可代表全身贮存铁的情况,是诊断缺铁的重要指标之一。骨髓内如肯定有可染铁的存在,则可排除缺铁性贫血。
2.铁染色是临床应用最广泛的细胞化学染色之一。其细胞内铁易受外界铁的污染,使内铁阳性率增高;而细胞外铁虽也会受污染,但较易辨认。铁染色主要用于缺铁性贫血和环形铁粒幼红细胞增多的贫血,而对于临床不明原因的贫血做铁染色外,还应做NAP染色和PAS染色。