常用血细胞化学染色-2

三、α一醋酸荼盼醋酶染色

染色原理

血细胞内的α-醋酸荼酚酯酶(α-naphythyol acetate esterase,α-NAE)在pH中性的条件下可水解基质液中的α-醋酸荼酚，释放出α-荼酚与基质液中的重氮盐偶联形成不溶的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐对坚牢蓝B，形成的有色沉淀为棕黑色或灰黑色。α-NAE存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，故它是一种中性非特异性酯酶。单核系细胞的阳性可被氟化钠抑制，所以做α-NAE染色时，通常同时做氟化钠抑制试验。

试剂器材

1.0.067mol/L磷酸缓冲液(pH7.6)。

甲液：Na₂HPO₄·12H2O 2.388g加蒸馆水至100mL。

乙液：KH₂ PO₄ 0.908g加蒸馏水至100 mL。

取甲液87mL，乙液13mL混合，调pH至7.6。

2.基质液0.067mol/L磷酸缓冲液50 mL，加10g/Lα-醋酸荼酚(用50%丙酮为溶剂)1.0mL，充分振荡，直至最初产生的混浊物(大部分)消失为止，加重氮盐(坚牢蓝B等)50mg，振荡，过滤后立即使用。

3.10 g/L甲绿水溶液。

操作步骤

1.固定新鲜干燥涂片置10%甲醛生理盐水中5min，自来水冲洗5min，待干。

2.显示放入基质液(37℃)1h，自来水冲洗。

3.复染l0 g/L甲绿水溶液复染5~15min，自来水充分冲洗，待干，镜检。

4.氟化钠抑制试验在1mL基质液中加入1.5mg氟化钠，其余按本染色法进行，染色步骤同上。

注意事顶

1.标本必须新鲜，应于取材后两天内染色。

2.重氮盐的选择依次为坚牢蓝B、坚牢蓝RR及坚牢黑B的染色效果为好。

实验评价

1.α-NAE染色是一种非特异性醋酶染色，是判断急性白血病的常规染色方法，在中性pH时用α-NAE作底物，正常单核细胞和原始单核及幼稚单核细胞均呈阳性反应，不被氟化钠抑制；其他血细胞则呈阴性或弱阳性反应，故α-NAE又称"单核细胞酶"，结合氟化钠抑制试验，对鉴别单核细胞白血病有重要价值。

2.有时单系细胞或粒系细胞、淋系细胞阳性较弱，因此难以判断加氟化钠后的抑制情况，且有时阳性细胞是由于假阳性所致。四、过碘酸-雪夫染色

染色原理

过碘酸是氧化剂，使含有乙二醇基(-CHOH-CHOH)的多糖类物质(糖原、黏多糖、黏蛋白、糖蛋白及糖酯等)氧化，形成双醛基(-CHO-CHO)。醛基与雪夫试剂中的无色品红结合，使其变成紫红色，定位于细胞内的多糖所在处。在过碘酸氧化前，用麦芽糖淀粉酶或唾液淀粉酶处理标本，再糖原染色，可鉴别是糖原还是其他多糖类物质，如被消化则是糖原，如不被消化则为其他多糖类物质。过碘酸-雪夫反应(periodic acid-Schiff reaction, PAS),以前又称为糖原染色。

试剂器材

1.l0g/L高碘酸溶液

HIO₄·2H₂O 1g

蒸馏水 加至100mL

2.雪夫染液取蒸馏水200 mL加人500 mL容量的三角烧瓶，加热至沸。移开火焰，缓慢加入碱性品红1g，继续加热2min，使之充分溶解后停止加热。冷却至60℃左右时，过滤，加入1mol/L盐酸20mL，混匀。待冷却至25℃加入偏重亚硫酸钠(Na₂S₂O₅)2g混匀，置带塞的棕色玻璃瓶中，放暗处24h后加活性炭1g，振荡混匀吸附色素，用滤纸过滤后密封在棕色瓶内，放冰箱保存。

3.亚硫酸液

100g/L偏重亚硫酸钠 6mL

1mol/L盐酸 5mL

蒸馏水 100mL

每次用前新鲜配制。

4.20g/L甲绿

甲绿 2g

蒸馏水 加至100mL

5.淀粉酶嚼石蜡刺激分泌唾液，收集唾液离心取上清液，内含淀粉酶，将麦芽糖淀粉酶0.1~1.0g溶于0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)100mL中。

操作步骤

1.固定新鲜干燥的涂片用95%乙醇固定10 min，蒸馏水冲洗，待干。

2.如涂片需要消化，可加唾液或麦芽糖淀酶，置室温消化60 min，然后用蒸馏水冲洗。

3.10g/L高碘酸氧化15~20min，蒸馏水冲洗，待干。

4.置雪夫染液中室温染色30~60 min。

5.用亚硫酸溶液冲洗3次后，再用自来水冲洗2~3min，待干。

6.20g/L甲绿复染10~20 min。

7.水洗，待干，镜检。

注意事顶

1.所用染色缸及器具应十分清洁、手燥。

2.固定试剂不同，染色效果不同。目前较常用的有95%乙醇、纯甲醇及甲醛蒸气，其中乙醇固定后糖原颗粒明显，各成熟粒细胞的反应有较明显的颜色差异，易于判断阳性反应的程度，且唾液消化后的对照标本没有假阳性，故通常选用乙醇为固定剂。

3.10 g/L高碘酸溶液质量要保证，变黄则不能用，氧化时间要准确，否则将导致假阳性或假阴性。

4.碱性品红试剂对染色的影响不同品牌的碱性品红染色效果不一，碱性品红的质量是试验成败的关键因素之一。雪夫(Schiff)染液应避光保存，无色，变红则失效。

5.染色后标本应及早观察和记录，染色后标本保存8天后，将逐渐褪色，保存时间延长，褪色更为明显。

实验评价

1.不同疾病血细胞的PAS染色呈不同程度的阳性反应，它在诊断恶性红细胞系疾病中最有价值(尤其是强阳性)；但要注意的是恶性红细胞系疾病并不都是阳性，良性红细胞系疾病也并不是全为阴性。

2.PAS染色在鉴别急性粒细胞白血病和急性单核细胞白血病中作用不大，而在诊断淋巴细胞白血病、鉴别脂质代谢障碍等疾病有一定价值。