ADC在体内可能会经历多种生物转化过程（如毒素分子代谢和去偶联）导致活性降低或完全丧失。由于ADC代谢物的分子量与原型ADC不同，LC-MS是识别和表征这类生物转化过程的理想技术。目前的方法有一定局限性，如需要特定的捕获试剂、对低质量数改变的代谢物分辨率不够、灵敏度低、需要用到毛细管或纳升LC-MS等非常规设备等。
来自BMS公司蛋白制品先导药物发现部门的Srikanth博士等人分享了基于LC-HRMS技术评价位点特异性ADC生物转化作用的通用方法[1]。
偶联位点可能影响ADC的药效和稳定性，在早期发现阶段，人们通过评估各个偶联位点来确定理想的ADC候选物。BMS公司的科学家们希望开发出通用的亲和捕获LC-MS工作流程，使用常规试剂，不受偶联位点和偶联化学反应影响，而且能评估任何ADC。
那么如何实现呢？
为了考察分析方法的适用性，BMS公司的科学家们使用微生物转谷氨酰胺酶（即mTG酶）通过化学-酶偶联方法偶联毒素分子，得到了6种在抗体不同位点偶联毒素分子的ADC。
01
评估轻链偶联ADC-1生物转化
图1：In vitro biotransformation analysis of ADC-1 (human mAb with a LC C-terminal Q tag, conjugated with a tubulysin payload, DAR 1.9).
ADC-1加入小鼠血清中孵育5天，于孵育完成后第0、1、2和5天取等份试样。
ADC-1的体外血清稳定性结果显示：
第0天，在25,306Da处观察到峰，这对应于偶联Tubulysin毒素分子的轻链。
第1天和第2天，在25,264Da处观察到新的峰，表明原型ADC损失了42Da。这个新的峰对应于偶联的Tubulysin毒素分子经脱乙酰作用形成的代谢物。
第5天，这种代谢物（即脱乙酰产物）的相对丰度超过了原型ADC。得益于此方法的高灵敏度和高分辨率，能够鉴定出质量变化很小的代谢物。准确鉴定和表征这种代谢物非常重要，因为有研究表明Tubulysin毒素分子的脱乙酰作用会导致ADC效价完全丧失。
02
评估重链Fab段偶联ADC-2生物转化
图2：In vitro biotransformation analysis of ADC-2 (human mAb with Q Tag in HC-Fab, conjugated with a tubulysin payload, DAR 1.9).
以添加不同浓度ADC-2的小鼠、大鼠和猴血清为样品，评估了该方法的灵敏度。即使50 mL小鼠血清中的ADC浓度低至0.5 μg/mL也获得了出色的灵敏度。与小鼠血清相比，大鼠和猴血清中存在更多的内源性干扰物。虽然0.5 μg/mL浓度下的谱图不够清晰，但两种样品分别在1 μg/mL和2 μg/mL浓度下得到了高质量谱图。总体而言，LC-MS方法灵敏度高，可以分析各种临床前物种50 mL血清中浓度在0.5-2 μg/mL范围内的ADC。
ADC-2的体外血清稳定性结果显示：
第0天，在27,382Da处观察到峰，这对应于带Tubulysin毒素分子的重链Fab段。
第1、第2和第5天，在27,340Da观察到新的峰，且该峰的相对丰度随时间而增加。两个峰的质量数相差42Da，表明新的峰对应原型ADC偶联的Tubulysin毒素分子经过脱乙酰化作用形成的代谢物。
与轻链偶联ADC-1相比，在第5天，这个重链Fab段偶联ADC上偶联的Tubulysin毒素分子的脱乙酰程度较低。
03
评估Fc段偶联ADC-3的生物转化
图3：In vivo biotransformation analysis of ADC-3 (N297A mAb (HC-Fc), conjugated with a tubulysin payload, DAR 1.9).
ADC-3是Fc段偶联ADC，DAR为2，且不含N-糖基。由于偶联位点在Fc段，捕获试剂从抗人F(ab'')2改为通用的抗人Fc试剂。将含有ADC的血清与磁珠共孵育，然后使用IdeS酶对Fc段偶联毒素分子的ADC进行磁珠上酶解，从而剪切掉Fab段，保留仍与磁珠结合的Fc段。选择性地洗脱Fc片段，然后进样至LC-MS进行分析。
ADC-3在小鼠体内的稳定性结果显示：
第一天，可在25,001Da处观察到主峰，并在24,959Da处观察到次要峰。
给药后第2、第8和第16天，24,959Da处的峰相对丰度随时间而增加。
这两个峰的质量数也相差42Da。小峰代表偶联的Tubulysin毒素分子经体内脱乙酰化作用形成的代谢物。
04
评估Fc段偶联ADC-4的生物转化
图4：In vivo biotransformation analysis of ADC-4 (N297Q mAb (HC-Fc), conjugated with a tubulysin payload, DAR 3.8).
ADC-4也是Fc段偶联ADC，但它的DAR为4，同样不含N-糖基。
ADC-4在小鼠体内的稳定性结果显示：
在给药后第1天，观察到两种原型物质，一种是带有2个Tubulysin毒素分子的Fc段，另一种是带有1个Tubulysin毒素分子的Fc段。
同时，还观察到另一种质量数为26,273Da的物质，它相较于原型物质的质量数差为42Da，是ADC偶联的两个Tubulysin毒素分子之一经脱乙酰化作用形成的代谢物。
这种代谢物的含量随时间明显增加，与此同时出现了另一种代谢物，其质量数与原型物质相差83Da。这种代谢物是ADC偶联的两个Tubulysin毒素分子同时发生脱乙酰化作用形成的。
在之后的时间点，实际上还观察到一种代谢物，其质量数为25,016Da，是Fc上偶联的Tubulysin毒素分子经脱乙酰作用形成的。得益于TOF仪器出色的灵敏度和分辨率，鉴定出这三种质量数变化很小的代谢物。
使用抗人Fc试剂捕获Fc偶联ADC，并使用IdeS进行磁珠上酶解。然而，经仔细研究发现，洗脱物中存在另一种物质，即部分酶解，只失去了一个Fc/2片段的ADC。
05
评估重链C端谷氨酰胺肽标签偶联ADC-5的生物转化
图5：In vivo biotransformation analysis of ADC-5 (human mAb with HC C-terminal QTag, conjugated with a tubulysin payload, DAR 2.0).
ADC-5的毒素分子与重链C端的谷氨酰胺肽标签偶联，并且具有N-糖基。因为ADC与磁珠的接触位点位于Fc段，形成了空间位阻，进而影响了酶与ADC的接触，导致酶解不完全。
为了解决酶解不完全的问题，BMS公司的科学家们开发了双重捕获方法，能够完全去除F(ab'')2片段以及Fc上的N-糖基。还通过在小鼠血清中加入不同浓度的ADC-5，评估了这种双重捕获方法的灵敏度。结果表明，即使50 mL小鼠血清中的ADC浓度仅为0.5 μg/mL，也能得到质量良好的谱图，再次证明Xevo G2-XS Tof系统具有出色的灵敏度。
ADC-5在小鼠体内的稳定性结果显示：
给药后15 min，在25,651Da处观察到主峰，这对应于带Tubulysin毒素分子的Fc段。
从给药后第2天开始，25,609Da处出现新的峰，其质量数与原型物质相差42Da。这个新的峰是ADC上偶联的Tubulysin毒素分子经体内脱乙酰化作用形成的代谢物。
给药后第14天，可以观察到此代谢物峰的丰度明显高于原型物质。
06
评估重链Fab和Fc段偶联的ADC-6生物转化
图6：In vitro biotransformation analysis of ADC-6 (human mAb with BD and tubulysin payloads conjugated on HC-Fab and HC-Fc, respectively)
为了评估这种方法分析更复杂的ADC以及通过其它偶联化学反应产生的ADC的适用性，BMS公司的科学家们生成了ADC-6。
ADC-6的体外血清稳定性结果显示：
在第0天，可以观察到两种物质，分别是未偶联的重链Fab段和带PBD毒素分子的重链Fab段。
从第1天开始，26,998Da处出现了次要峰，其质量数与原型物质相差309Da。可以观察到这个新峰的相对丰度随时间增加。观察到因ADC上偶联的毒素分子的酰胺键发生蛋白酶切，导致药物部分结构丢失而形成的代谢物。表明此方法可用于分析其它种类的毒素分子。
第二种洗脱物得到的数据显示：
第0天，可以在24,942Da处观察到峰，这对应于通过马来酰亚胺连接子偶联Tubulysin毒素分子的Fc段。
第1和第2天，可以观察到两个新的峰。标记为1的峰与原始物质的质量差为18Da，而标记为2的峰比原始物质的质量减少42Da。
第5天，还可以在26,998Da观察到第三个峰，与原始物质相比质量减少24Da。实际上，在第5天，原始物质的相对丰度有明显降低。标为1的峰质量增加18Da，其增量对应由琥珀酰亚胺水解和开环形成的代谢物。而质量减少42Da是通过共联Tubulysin的脱乙酰作用形成的。质量减少24Da的峰标记为1和2，是由琥珀酰亚胺水解和Tubulysin脱乙酰共同作用形成的。
这表明该分析方法还可用于其他偶联化学方法制备的ADC。重要的是，此结果再次突出展示了Xevo G2-XS Tof系统的出色分辨率，能够鉴定质量变化为18、24和43Da的三种代谢物。
07
分析方法通用性评估
BMS公司的科学家们生成了25种不同的ADC（其毒素分子偶联于抗体的不同位点），还评估了多种类型的抗体和毒素分子以评估分析方法的通用性。
图7：Universal applicability of assay for multiple ADCs with payload conjugated at 25 different sites on LC (Blue), HC-Fab(Green), hinge(Orange) and HC-Fc (Red)
总体而言，在临床前研究中，该分析法可用于评估任何位点特异性ADC的生物转化，不受抗体类型、偶联化学方法以及偶联位点影响，且可使用市售通用试剂进行（样品制备时间少于7小时）。策略是将完整ADC的大小从150kDa减少到25kDa，以质谱出色的灵敏度和分辨率鉴定ADC代谢物。
BMS公司科学家开发的评估位点特异性偶联ADC生物转化的LC-HRMS通用方法，可以作为借鉴，用于临床前研究更好地评估、确定理想的ADC候选药物。
线上研讨会
为深入讨论ADC药物分析技术发展趋势并分享成功案例，沃特世与烟台迈百瑞国际生物医药有限公司联合开展线上研讨会。
会议主题：ADC药物分析技术趋势解读与案例分享
会议时间：2020年11月3日 09:30 - 11:30
会议概要：
① ADC药物产品质量属性的科学理解和控制策略；
② LC-MS分析方法实施的关键点与新方案；
③ 纯化技术应对工艺挑战等话题。
注：讲座仅向实际工作中涉及ADC研究的质量工作者开放。
我们将在收到您注册信息后的3个工作日内，与您完成信息核实并发送会议链接。
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参考文献：
1.Universal Affinity Capture Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Assay for Evaluation of Biotransformation of Site-Specific Antibody Drug Conjugates in Preclinical Studies, Srikanth Kotapati, etc. Anal. Chem. 2020, 92, 2065−2073
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