牛初乳通常是指奶牛分娩后7d特别是3d 内所分泌的乳汁。目前,牛初乳作为一种功能性食品的原料已经受到普遍关注,它的特殊性首先体现在其化学组成及活性物质的含量上。牛初乳免疫球蛋白(Ig)总量约为 50~100 mg/mL,其中80% 以上是IgG。免疫系统发育不健全的新生牛犊吸收的IgG以未消化的状态直接通过肠壁进入血液而获得被动免疫,这种被动免疫可保护犊牛免受外来疾病的侵袭。
目前,国内外测定IgG的方法有酶联免疫吸附法、琼脂单、双向扩散法、放射免疫法、高效液相色谱法等。其中高效液相色谱法具有分离效率高,选择性好,检测灵敏度高等优点,本文根据国家标准GB/T 5009.194-2003《保健食品中免疫球蛋白IgG的测定》,建立了利用高效液相色谱LC-5520测定牛初乳粉中免疫球蛋白IgG的方法,供相关乳制品企业质量控制部门人员参考。
LC-5520液相色谱仪
实验原理
根据高效亲和色谱的原理,在磷酸盐缓冲液条件下免疫球蛋白IgG与配基连接,在pH 2.5 的盐酸甘氨酸条件下洗脱免疫球蛋白IgG。
仪器设备与试剂
实验条件
色谱柱:Pharmacia HI-Trap Protein G 柱,1 mL;
流动相A:pH 6.5,0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液;
流动相B:pH 2.5,0.05 mol/L 甘氨酸盐酸缓冲液;
流 速:0.4 mL/min;
检测波长:280 nm;
进样量:20 μL。
样品处理
称取 0.1 g(精确至 0.001 g)试样,用流动相A稀释至25.0 mL,摇匀,通过0.45 μm微孔滤膜后进样。
图1 IgG标准曲线
样品分析
将试样待测液进行色谱测定如图2所示。记录色谱峰峰高,根据标准曲线计算出试样待测液中IgG的浓度。
图2 奶粉IgG图谱
根据标准曲线计算结果:某品牌牛初乳 IgG含量为:1.08mg/mL 。
本文建立了一种利用LC-5520高效液相色谱仪测定牛初乳中IgG的含量的方法,采用0.05 mol/L 磷酸盐缓冲液和0.05 mol/L 甘氨酸盐酸缓冲液为流动相,对IgG进行含量测定。实验证明,线性关系良好,相关系数r≥0.999。该方法简便快速,重现性好,灵敏度高,可以满足乳制品企业牛初乳中IgG质量控制中。
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