前言
胆碱是一种强有机碱性化合物，以游离胆碱、乙酰胆碱和复合磷脂的形式分布于生物体内。它参与生物膜和脂蛋白的形成，也与中枢神经系统的运作密切相关，因此是人体代谢中非常关键的物质。为保证胆碱摄入，通常在配方奶粉、保健品和婴幼儿辅食中以酒石酸盐或氯化盐的形式添加一定量的胆碱。
2021年发布的新版婴幼儿配方食品标准GB 10765-2021《婴儿配方食品》和GB 10766-2021《较大婴儿配方食品》中，胆碱从可选择成分调整为必需成分，并且指定的检测方法也更新为GB 5413.20-2022 《婴幼儿食品和乳品中胆碱的测定》，该方法于2022年12月30日开始实施。
默克根据国标第三法，采用液相色谱-串联质谱检测奶粉中的胆碱，并使用同位素内标对其进行定量。实验中使用的Supelco®标准品胆碱酒石酸氢盐（货号：PHR1460）为有证标准物质，完全符合国标对于标准品的要求，稳定同位素氯化胆碱-D4（货号：615544）可以根据需求定制不同的包装。色谱柱Ascentis® Express RP-Amide（货号：51576-U）为默克最先商业化的表面多孔（核壳）结构色谱柱，可以同时实现快速高效的色谱分离，默克RP-Amide柱还做为化妆品中禁限用染料检测专用柱引入《化妆品安全技术规范》，是市场上酰胺键合相色谱柱的领导者。
实验部分
1. 样品前处理：
样品制备：
称取1g奶粉样品，溶于75℃水中，转移至100mL容量瓶，冷却至25℃，加水，混匀。吸取1mL样液于50mL离心管，备用。
样品提取：
上述离心管中加入1000mg/L胆碱D4内标溶液50μL，加入1mol/L盐酸溶液10mL，混匀，超声震荡5min。将样品溶液在70℃±2℃水浴中加热3h（每30min振荡一次），冷却至室温。用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至5.0-5.3，转移至100mL容量瓶中，用水定容，将1mL溶液用10mmol/L甲酸铵水溶液稀释至10mL容量瓶中，过0.22μm水性滤膜，待测。
2. 色谱/质谱参数：
3. 检测谱图：
标准曲线
标样及奶粉样品谱图
图1. 胆碱标液及其内标(0.15 mg/L) MRM谱图
左右滑动查看图表
图2. 奶粉加标样品 (50 mg/kg) MRM谱图
图3 空白奶粉样品MRM谱图
结论
本方法建立了高效液相色谱-串联三重四极杆质谱（HPLC-MS/MS）测定婴幼儿配方乳粉中胆碱的方法。胆碱在0.01~0.20mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数大于0.999，检出限1.5 mg/kg。胆碱化合物的回收率为86.0%～89.0%，相对标准偏差（RSD，n=7）为1.13%。
相比于C18柱，RP-Amide键合相对极性化合物具有更出色的保留能力，并且可以改善碱性化合物峰形，非常适合强极性的胆碱测定。方法使用HILIC模式，得到稳定、不受奶粉基质干扰的色谱峰，因此适用于婴幼儿配方乳粉中胆碱的快速检测。
RP-Amide酰胺键合相
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