核酸中的蛋白质污染难以识别？别怕，这个方法事半功倍

赛默飞化学分析

2023.7.24

作者赛默飞中国

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核酸中的蛋白质污染鉴定难度大

苯酚-氯仿法是核酸提取的经典方法，却极易在回收水相中的核酸时引入蛋白污染。这将导致：

A260读数偏高（核酸在260nm处有吸收），计算核酸浓度偏大；

污染蛋白通过抑制或干扰酶促反应，影响下游的RT-PCR及qPCR结果，但是由于蛋白质的消光系数远小于核酸的消光系数(蛋白中色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸的二硫键在280nm处有吸收)，因此需要蛋白质浓度达到较高的水平才能在A260/A280的比值上体现出来(Glasel,1995,Hubeman,1995,and Manchester,1995)1-3，这给核酸中的蛋白质污染鉴定带来很大难度。

解决方案

针对这一难点，NanoDrop One/OneC和NanoDrop Eight超微量分光光度计内置了Acclaro智能污染物分析系统，能够基于光谱数据库和独特的算法准确识别、鉴定出待测样品中的污染物质，并实时给出校正后样品真实浓度（见下图1）。今天我们通过实验解析蛋白污染对核酸样品纯度、定量的影响，以及NanoDrop One是如何准确识别此类污染，并给与准确校正的。

下图1 Acclaro智能污染物识别功能提示

样品中可能存在的污染物

1a) 检测结束之后，在浓度前会显示黄色三角形，提示在此dsDNA样本中检测到污染物

1b) 吸光度光谱图中，蓝色表示原始光谱(DNA加污染物)、绿色表示修正后光谱(DNA减污染物)、黄色标识污染物光谱，右上角给出包括校正前后的样品浓度A260/A280、A260/A230比值和存在的污染物及类型

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实验过程

将dsDNA标准品（鲑鱼精子DNA溶液）和蛋白样品（BSA溶液）按照不同比例混合得到九组混合物（见表1）。使用NanoDrop One分别测量九组混合物dsDNA浓度，每组溶液均重复测量五次，计算平均浓度和标准偏差(SD)（结果见表2）。

表1 不同量的DNA 和蛋白原液混合比例

表2 NanoDrop One 测量混合物中DNA浓度

表2中，The original（uncorrected）DNA 浓度是NanoDrop One直接测出的数据，The corrected DNA浓度（混合物5–9）是NanoDrop One Acclaro软件分析并校正后的数据。（注：混合物1-4由于污染蛋白浓度过低，不足以触发Acclaro软件的分析校正功能，因此使用Thermo Scientific™ TQ Analyst™ software package来做光谱分析完成数据校正。)

实验结果

观察该表中original DNA浓度数值及纯度比值，可以看出蛋白污染对核酸样品浓度的影响规律：

不同程度的蛋白污染，都会导致核酸浓度虚高。且污染蛋白含量越高，核酸的测量值和真实值偏差越大。

足够高的蛋白含量才能够引起260/280纯度比值的显著变化。本例中污染蛋白比例占到近72%时，A260/A280纯度比值为1.74，仍处于可接受范围内。当污染水平从72%增加到98%时，A260/A280纯度比值才从1.74稳步降至0.89。

同时，从该表中corrected DNA浓度以及黄色警示标识表示可以看出NanoDrop One的污染物校正功能特点：

能够准确识别并且定量核酸样品中的蛋白污染，超出一般实验可接受范围时给与警示符号提示。

使用Acclaro软件，校正后的核酸浓度与真实值的偏差控制在10%范围内。即使对于98%的极端蛋白污染浓度，Acclaro给出的校准值依然在此范围内，且具有高度可重复性。