方法规定的键合相是什么?哪种键合相(以及分离模式)会比较合适?
2色谱条件是什么?如在高盐流动相或高温条件下,什么样的填料基质或键合方式会比较耐用?
3分析物的分子量范围是多少?需要根据分子量大小选择不同孔径吗?
4检测任务繁重,需要提高分析速度或检测通量吗?
5全多孔颗粒VS实心核(表面多孔)颗粒,载量高VS柱效高,如何根据项目情况来进行选择?
提到速度与通量,越来越多的分析人员追求更高的效率,也越来越青睐短小高效的色谱柱。可是,实验室摆满了不同规格大大小小的色谱柱,也挤满了不同品牌、不同时期的仪器系统,从HPLC、到UHPLC、甚至UPLC,都无所不包。
很多分析人员,只知道色谱柱的耐压能力要与系统的日常运行压力相匹配,却不知道系统还会影响柱效和分离度。这导致大家在日常使用中,常常发生因为色谱柱与仪器的匹配不佳而使得分析结果不理想、项目速度受到影响的情况,如下图:相同色谱柱相同色谱条件在不同仪器上测试结果差异明显。
今天,我们针对这个典型问题,好好解说解说。
柱规格,指色谱柱的内径及长度,如常规在HPLC仪器上使用的4.6×250 mm色谱柱,其中4.6是柱内径,250是色谱柱柱长。
不同规格的色谱柱,要用在与之相匹配的系统上,才能发挥出应有的效果。从下图中可以看到,对相同长度的色谱柱,柱内径减小时,可选用的仪器平台会受到限制,如2.1×50 mm色谱柱,仅在UPLC系统上才能发挥出其应有的柱效。
这是因为色谱柱体积越小,越容易受到系统扩散体积的影响。系统扩散体积,也就是我们常说的死体积,是指从进样器开始、直至检测器之间,除了色谱柱本身以外,样品所有流经的路程。样品在这些通道中不断的扩散,色谱图上表现为峰展宽,随之峰高降低,分离度也因此变差。
如下图所示,不合适内径和长度的连接线以及不正确的连接均会产生死体积,导致峰形欠佳。
系统死体积测试方法
谱带展宽测定应当在配有检测器的液相色谱系统上进行。
1)断开色谱柱与系统的连接并替换为零死体积二通。
2)将泵系统的流速设置为1 mL/min。
3)使用的测试混合物(在流动相条件下溶解)其最大峰高响应值应低于0.5 AU。
4)进样此溶液2-5 μL。
5)采用5-Sigma法测量4.4%峰高处的峰宽(分钟)。
谱带展宽(μL)=峰宽(min)×流速(μL/min)
(例如,如果峰宽=0.1 min,流速=1000 μL/min。那么谱带展宽=100 μL)
知识小结
1)当您的色谱柱越“大”——柱规格较大,它对液相系统就不那么“挑剔”;
2)当您的色谱柱看起来越小——比较细,或者比较短,或者兼而有之,如果您的项目还比较难分,一定要把色谱柱放在死体积较小的系统上使用,同时还要特别注意连接色谱柱时不要造成额外死体积;
3)可以参考如下,作为系统与色谱柱选配的指导。
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前几期我们解释了影响色谱柱性能的相关参数,如键合相、键和方式、填料基质等。为方便您快速了解沃特世不同色谱柱的特点及温度/pH适用条件,我们整理了“沃特世色谱柱和分析标准品与试剂选择指南”挂图,如您需要可扫描二维码申请~
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往期回顾
► 色谱柱的使用(二)极性农药分析专用柱Torus DEA 的使用技巧