厉害了！一天搞定上万个杂交瘤筛选与分析

前言

单克隆抗体是许多治疗方法的根基，比如抗体偶联药物、双特异性抗体和CAR-T细胞疗法。今年四月，FDA批准了第100个单克隆抗体：葛兰素史克 PD1 阻断剂 dostarlimab ，标志着“百抗时代”的正式到来。尽管这些获批单抗的作用机制、抗原表位和抗体形式有所不同，但是可以结合相同的靶点或者结合单一信号通路的多个靶点，这种激烈的竞争格局也对药物开发人员提出了全新挑战——以最高的效率开发具有更完善作用机制、药代动力学以及给药系统的新一代抗体药物。

新一代抗体药物专注于更具挑战性的治疗靶点，例如G蛋白偶联受体（GPCR），需要能够进行大规模筛选的高通量方法，以及能够轻松分析大量复杂数据的自动化软件来助力。

iQue®高通量流式细胞仪为新一代抗体发现于开发提供了一个完整的解决方案，它巧妙结合了高通量采样、流式细胞术和基于多孔板分析的优点，仅需极微量样品便能够在20min内完成384孔板的检测。配合ForeCyt®软件特有的Plate Map, Profile Map以及Panorama功能，快速提供能够指导下一步操作的可视化结果，精简并加速抗体发现和开发。

如何精简和加速？一起来看看ImmunoPrecise Antibodies（原ModiQuest Research）公司的应用案例吧。

下载应用指南

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ImmunoPrecise抗体的发现三个主要阶段为：

稳定细胞系建立；

血清评价；

大规模杂交瘤克隆筛选。

iQue®在每一个阶段都最大程度地加速了简化了实验。

1

细胞系生成

——快速节约的高通量筛选，灵活自动化的数据分析及排序

为了开发稳定的细胞系，ImmunoPrecise用含有编码靶抗原的慢病毒转导细胞。尽管通过慢病毒介导能够大大提高基因的转导效率，但是由于许多蛋白质难以表达，仍然需要非常大量的筛选工作。在选择性培养基中对转导细胞培养约两周后，将其中一半移入96孔板，洗涤并加入荧光标记的特异性抗体混匀。使用iQue®和ForeCyt®自动化软件一小时内即快速完成了四百多个克隆（分装于5块96孔板）抗原表达水平的分析（图1A），同时进行细胞计数，并根据细胞数对表达量排在前25的克隆进行排序，监测细胞生长指标(图1B)。

A. Plate View靶抗原的表达水平

B.分析图筛选标准：1. 抗原表达水平高2. 细胞数量多

图1.稳定靶细胞系的生成。A）每个孔中细胞的抗原表达水平。其中红色代表克隆的抗原表达水平，灰色代表未转导的亲代阳性对照细胞的抗原表达水平。B）根据抗原表达水平和细胞数含量筛选出排名前25的孔。

2

血清评估

——多步骤合一，同时检测靶抗原和对照抗原结合能力，并筛选交叉反应性

开发新一代抗体通常需要以多种不同方式将抗原呈递给免疫系统，以确保获得具有所需特性的抗体。ImmunoPrecise研究中，分别使用了纯化蛋白、表达抗原的DNA质粒、表达抗原的细胞和脂质包埋抗原四种方式对36只BALB/c小鼠进行免疫接种（每组9只）。将免疫前和免疫后的36只小鼠的血清进行8倍稀释，并进行抗体滴度测试抗体对2500份稀释血清进行重复检测。

iQue®使用一种独特的编码方式来验证抗体特异性：用不同强度的荧光染料编码表达靶抗原、相关抗原或亲代细胞系的细胞，并混合到同一个孔中。将三种不同的分析组合成一组分析，大大加快了分析效率。随后通过荧光差异对各个细胞群进行分离。HeatMap显示了抗体与对照细胞、表达靶抗原的细胞和表达无关抗原的细胞结合的结果（图2）。

图2.用于小鼠血清评价的复合分析。在亲代对照细胞中未观察到与免疫前血清或免疫血清的抗体结合。相反，来自许多动物的免疫血清显示出与抗原特异性表达细胞的高度结合，而在免疫前血清中未观察到结合。在相关抗体表达细胞中测定到中等程度的结合，并且这些细胞与抗原特异性细胞重叠。这表明产生了可以与相关蛋白结合的多克隆抗体应答。

3

杂交瘤筛选

——确保构象完整的天然活细胞检测模式，一天内完成近万个杂交瘤筛选分析。

根据步骤二中数据，选择了两只小鼠进行杂交瘤的生成。为了最大限度地识别抗体leads，在分析之前，9600个杂交瘤被置入25个384孔板中生长14天。之后，将杂交瘤克隆的上清液与用于抗体滴度测定的三个编码细胞系混合，用以测定抗体结合和特异性。由于iQue®仅需极微量的上清，因此可将多余的上清液用于重复测试或下游功能分析，从而降低成本并加快抗体发现过程。整个筛选过程和数据分析一天内即可完成。三个细胞系的抗体结合情况如图3所示。

图3. 杂交瘤多重筛选。使用ForeCyt®软件中的Panorama功能显示整个筛选的结果。Heat Map（红色）显示抗体与对照细胞、表达靶抗原的细胞和表达无关抗原的细胞结合的结果。Profile Map（蓝色）将三种细胞类型的结果综合起来，显示只与靶抗原结合，与无关抗原或阴性对照不结合的抗体。

总结

ImmunoPrecise Antibodies在抗体发现流程中的多个步骤使用iQue®，以加快产生抗体leads的时间。iQue®和集成的ForeCyt®软件对其用户的价值在于快速、高通量的采样以及实时、多重性孔板数据分析。多重细胞分析将多个分析组合到一项研究中，简化并加快了抗体筛选工作流程。“微型化”的分析模式降低了成本，节省了宝贵的抗体上清液，使其可用于额外的验证性或功能性研究。