高效液相色谱在使用过程中常会出现一些影响分析结果的问题，如果使用人员了解常见问题及其成因和相关解决方法，就能做到早预防勤维护，使分析结果保持较好的稳定性与较高的精确性。
高效液相色谱仪系统组成：液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。
高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。
柱压问题
柱压问题是使用高效液相色谱仪过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50 PSI（3.3 Bar）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。压力过高、过低都属于柱压问题。
压力过高
这是高效液相色谱仪在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时，我们应该分段进行检查。
1）首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。
处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，再检查；
2）打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。
处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。如果压力降至100 PSI（6.7 Bar）以下，过滤白头正常，再检查；
3）把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。
处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。
压力过低
1）压力过低的现象一般是由于系统泄漏，处理方法：寻找各个接口处，特别是色谱柱两端的接口，把泄漏的地方旋紧即可；
2）当然还有一个原因就是泵里进了空气，但此时表现的往往是压力不稳，忽高忽低，更严重一点会导致泵无法吸上液体。处理方法：打开Purge阀，用3~5 ml/min的流速冲洗，如果不行，则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。
漂移问题
主要包括基线漂移和保留时间漂移。
基线漂移
一般说来，机器刚起动时，基线容易漂移，大概要半个小时的平衡时间，如果你用了缓冲溶液或缓冲盐，还有就是在低波长下（220 nm）平衡时间相对会比较长，但如果你在实验过程中发现基线漂移，则你要考虑下面的原因：
1）柱温波动。解决方法：控制好柱子和流动相的温度，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱；
2）流通池被污染或有气体。解决方法：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池（最好断开柱子）。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用盐酸）；
3）紫外灯能量不足。解决方法：更换新的紫外灯；
4）流动相污染、变质或由低品质溶剂配成。
解决方法：检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂；
5）样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。
解决方法：使用保护柱，如有必要，在进样之间。在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子；
6）检测器没有设定在最大吸收波长处。解决方法：将波长调整至最大吸收波长处；
7）流动相的PH值没有调节好。解决方法：加适量的酸或碱调至最佳PH值。
保留时间漂移
保留时间重现是液相性能好坏的一个重要标志，同一种东西，两次的保留时间相差不要超过15 s，超过了半分钟可看做保留时间漂移，就无法进行定性，你要考虑以下原因：
1）温控不当。解决方法：调好柱温，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱；
2）流动相比例变化。解决方法：检查四元泵的比例阀是否有故障；
3）色谱柱没有平衡。解决方法：在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱；
4）流速变化。解决方法：重新设定流速 ；
5）泵中有气泡。解决方法：从泵中除去气泡 。
峰形异常问题
峰型问题是液相的主要问题，在做液相过程中，我们就是要变换不同的条件来改善不好的峰型，对于各种各样的异常峰，要区别对待，从主要问题出发，一个一个加以解决。
1）色谱图中未出峰。解决方法：系统未进样或样品分解；泵未输液或流动相使用不正确；检测器设置不正确；针对以上情况成因作相应调整即可。
2）一个峰或几个峰是负峰。解决方法：流动相吸收本底高；进样过程中进入空气；样品组分的吸收低于流动相。
3）所有峰均为负峰。解决方法：信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒；光学装置尚未达到平衡。
4）所有峰均为宽峰。解决方法：系统未达到平衡；溶解样品的溶剂极性比流动相差很多；色谱柱尺寸及类型选择不正确；色谱柱或保护柱被污染或柱效降低；温度变化造成的影响。
5）所出峰比预想的小。解决方法：样品黏度过大；进样品故障或进样体积误差；检测器设置不正确；定量环体积不正确；检测池污染；检测器灯出现问题。
6）出现双峰或肩峰。解决方法：进样量过大；样品浓度过高；保护柱或色谱柱柱头堵塞；保护拄或色谱柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。
7）前伸峰。解决方法：进样量或样品浓度高；溶解样品的溶剂较流动相极性强；保护柱或色谱柱污染或失效。
8）拖尾峰。解决方法：柱超载，降低样品量；增加柱直径采用较高容量的固定相；峰干扰，对样品进行清洁过滤；调整流动相；硅羟基作用，加入三乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH值；柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢；加在线过滤器，对样品进行过滤；死体积或柱外体积过大，将连接点降至最低；尽可能使用内径较细的连接管；柱效下降，更换柱子；采用保护柱，对柱子进行再生。
9）出现平头峰。解决方法：检测器设置不正确；进样体积太大或样品浓度太高。
10）出现鬼峰。解决方法：进样阀残余峰，在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统；样品中存在未知物，改进样品的预处理；流动相污染，更换新流动相，尽可能现配现用，隔夜的流动相再次使用时要过滤；尽可能使用HPLC级试剂；流路中有小的气泡，打开Purge阀，加大流速排除。
以上内容只是对液相色谱中出现的常见的问题进行了分析，在故障排除时要遵守以下原则：（1）一次只改变一个因素，确定假定因素与问题之间的联系；（2）如果通过更换组件来排查故障时要注意将拆下的完好组件装回原位，避免浪费；（3）养成良好的记录习惯，这是成功进行故障排除的关键。
总之，在使用高效液相色谱时一定要注意样品的前处理与仪器的正确操作和保养。
在日常的使用过程中，仪器条件经常变化，色谱柱经常拆卸，因此需要对色谱仪经常检定以发现仪器性能的变化。但有不少实验人员因为不熟悉仪器的结构原理，不甚了解仪器的技术指标对分析测定结果的影响，而不能将仪器调整到最佳状态，从而直接影响到所测定数据的准确性。
如果实验人员能注意检定液相色谱仪的一些问题，则会大大延长仪器的使用寿命，并使仪器的性能得到最大限度的发挥。下面，我们重点讨论液相色谱仪检定中常见的几个影响因素以及解决问题的方法：
气泡
由于HPLC系统中气泡的存在，会造成色谱图上出现尖锐的噪声峰，严重时会造成分析灵敏度下降；气泡变大进入流路或色谱柱时会使流动相的流速变慢或不稳定，使基线起伏。
造成上述现象的主要原因有三条：一是流动相溶液中往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡；二是系统开始工作时未能将流路中的空气驱赶干净；三是在注入样品时不注意混入了空气。
为了避免这类问题的出现，HPLC实际分析过程中必须重视对流动相进行脱气处理；在HPLC系统开始工作前，可以用注射器连接恒流泵的排空阀，抽入流动相，将流路中的空气驱赶干净；在注入样品前注意排出样品注射器中的空气。
柱温
在操作HPLC时，色谱柱是在室温环境下工作的。大多数的工作环境温度是不断变化的，温度的差别就会引起较复杂的问题。温度的影响在所有的色谱分析方式中都是存在的，HPLC方法中的洗脱方式受温度的影响。
1）等度洗脱时温度会影响保留时间。当温度升高时所有的色谱峰都前移了，等度洗脱时一般温度每升高1℃，保留时间会缩短（1~3）%。
2）温度变化对梯度洗脱和等度洗脱的影响趋势是一样的，但是对梯度洗脱的影响要小于对等度洗脱的影响。即便如此，若梯度洗脱时不控制温度的话，保留值一般也会有较大的变化。
3）温度变化还可能引起选择性显著变化。
正如柱子不能完全平衡将导致保留时间的重现性差一样，柱温不平衡也会导致不理想的后果，这个问题在峰宽上的影响尤其明显。当温度变化时除了选择性和保留时间的变化之外，峰宽也会发生变化。升高温度通常会使理论塔板数升高，峰宽变窄，由于峰面积不变，峰越窄就会越高，因此升高温度可以达到更小的检测限。
4）柱子里的温度变化也会影响峰形。当流动相和柱子之间的温差增大时，由温度不平衡而导致的峰变形就会加剧。
为了获得一致的结果我们必须要控制柱温，使用柱温箱是最好的办法。如果没有柱温箱，最有效的办法就是将色谱柱隔绝在一个温度波动最小的地方。
色谱柱污染
色谱柱污染会引起保留时间漂移。HPLC色谱柱是非常有效的吸附性过滤器，它可以过滤并吸附流动相携带的任何物质。污染源可能是：流动相本身，流动相容器，连接管、泵、进样器和仪器密封垫，以及样品等。
样品中如果存在色谱柱上保留很强的组分，就可能使保留时间漂移。通常样品中的强保留组分具有较高的分子量，在此情况下，保留时间漂移的同时或其后会有反压的增加。可以通过使用固相提取等样品前处理方法来去除样品基质的影响。
避免色谱柱污染最简单的方法是防患于未然。相比之下，找到问题的所在并设计有效的清洗步骤以去除污染物要困难的多。通常使用在给定色谱条件下的强溶剂，但并非所有污染物都可以在流动相中溶解。使用保护柱是个非常有效的方法。反冲色谱柱仅是不得已时采用的办法。
色谱柱平衡
如果我们观察到保留时间漂移，首先应考虑色谱柱是否已用流动相完全平衡。通常平衡需要10~20个柱体积的流动相。但如果在流动相中加入少量添加剂则需要相当长的时间来平衡色谱柱。需要柱子的充分平衡，然后才能对HPLC进行检定。
流动相有机溶剂
流动相有机溶剂可能影响HPLC的检测限。分析中要求使用HPLC纯的试剂，关键是两点：纯度高、紫外吸收小。
纯度高，是希望没有杂质干扰HPLC分析；不会有金属离子损害纯度为99.99%以上的高纯度硅胶基质。
可以通过重蒸分析纯溶剂；或滤膜过滤，并定期把前置的过滤头取下，放稀硝酸里清洗，再用纯水洗至中性。
柱压
柱压过高是HPLC分析中常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题。
1）溶剂或样品含有颗粒杂质，这些杂质将筛板堵塞引起压力上升，应更换柱子入口筛板；
2）泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；
3）比例阀失效，应更换比例阀；泵密封垫损坏，应更换密封垫；系统检漏，则找出漏点，密封即可。
HPLC分析中，在色谱柱正常，样品灵敏度足够，分析方法合适，色谱峰在出峰时间较短的条件下，峰形应对称而尖锐。充分考虑到可能影响分析结果的因素，可以科学地进行液相色谱仪的检定。
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