亚克隆技术

一、目的与原理
限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，该类酶是体外剪切基因片段的重要工具。实验主要通过EcoR Ⅰ,Hind Ⅲ两种限制性内切酶对λ DNA的单切酶、双切酶及部分酶切的操作，掌握内切酶的实验操作技术。
二、材料与试剂
1．材料：λDNA
2．仪器：
离心机，恒温水浴，取液器，电泳仪，电泳槽，紫外观测仪
3．试剂
EcoRI及缓冲液，HindIII及缓冲液，λDNA,TAE缓冲液
三、操作步骤：
EcoRI、HindIII单酶切及部分酶切
取2只干净、灭菌新Eppendorf管，分别按下表加入
试剂 A（μl）
灭菌水 0
10×缓冲液 2
质粒 5
染色体DNA 12
EcoR I
1
HindIII
0
总体积 20
37℃保温1—2小时。保温结束后，分别加入0.5M（pH8.0）EDTA（使终浓度达到10mM）。加入6μl电泳加样缓冲液。
电泳。
EcoRI、HindIII双酶切
取1只干净、灭菌新Eppendorf管，按下表
加入试剂 体积（μl）
灭菌水 14
10×缓冲液 2
λDNA 2
EcoR I
1
HindIII
1
总体积 20
37℃保温1—2小时。保温结束后，分别加入0.5M（ pH7.2）EDTA（使终浓度达到10mM）。加入6μl电泳加样缓冲液。电泳分析。
四、结果 （略）
五、注意事项
1、 酶的量不超过总体积的1﹪，以为酶的保存液中含有甘油，甘油太多会形成星活性，切下非目的片段。
2、 在加入模板DNA以前可加入少量BSA，减轻管壁对酶的吸附作用。
3、   如果用双酶切，必须注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可以用同种缓冲液，则可同时水解，否则低盐浓度的限制酶必须先用，随着调节盐浓度，再用高盐浓度的限制酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿（1：1）抽提，加0.1倍体积的3mol/LnaAc和2倍体积的无水乙醇，混匀后-20℃放置30分钟，离心，干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。