PCR扩增产物的克隆技术-1

利用各种PCR技术扩增特异DNA是获得目的基因和特异探针的一种最有效、最简便的方法。但PCR扩增出的片断如不经进一步克窿是无法变成可利用基因，因此PCR扩增产物的克窿技术是DNA重组技术中的一个最重要部分，该技术是目前分子生物学实验中最重点内容，要综合前面实验中所介绍的各种技术，起着承上启下的作用。PCR产物的克隆一般要经过PCR产物的纯化、产物与载体的酶切、脱磷及连接、转化、筛选等几个步骤实现。PCR产物与载体的连接方式有实验八中提到的溶液连接和胶内连接，可粘连、平连、粘平连及与T－载体的单位点配对连接（见图9－1）。

PCR产物 PCR产物 PCR产物 PCR产物 PCR产物

（上下游引物中各带 （上下游引物中仅有（上下游引物 （PCR产物与载体

一种特异酶切位点）一种特异酶切位点） 中无酶切位点） 均有两个酶切位点

但只有一个是相同的）

PCR产物 纯化回收

PCR产物及载体 PCR产物单酶切 PCR产物Klenow酶补平PCR产物与载体 T－载体

双酶切，载体脱磷 载体双酶切、脱磷 载体用平末端酶切割 双酶切载体脱磷 单碱基

粘连 粘连, Klenow酶补平载体脱磷后平连 粘连 Klenow补平 粘连

后平连 或加接头粘连酶补平 平连

1：PCR产物克窿方式示意

粘连时载体与外源DNA的比例1：3比较合适，而平连时可达到1：10

在这些方法中，T－载体技术比较简便有效的，尤其对于一些多克隆位点的可选择内切酶种类稀少的表达载体该技术特别适用。该方法具有不需对引物进行特殊酶切位点的修饰，即能直接进行PCR产物的克隆，并具有克隆效率高的特点。通用载体的T-载体有商品出售，一些特殊载体的T－载体可自己制备。T-载体均是通过载体是通过用EcoRⅤ或SmaI等平末端酶将相关载体切割出平端,然后再在其两个3`端加上T而构成的。这些存在于插入位点的突出的3`末端可防止载体的自身环化,并为PCR产物提供碱基配对区（因PCR扩增产物的3`末端为非特异性的A碱基）而有效地提高了PCR扩增片断的克隆效率。

本实验中用pGEMR-T载体为材料，来让学员学习T－载体克窿技术。PGEM－T载体来自于PGEM系统载体，这类载体中中含有T7和SP6RNA聚合酶的启动子系列,该系列侧翼为一多克隆位点区,该区有β-半乳糖苷酶的α-肽端的编码区。β-半乳糖苷酶的α-肽编码区的插入失活,能使重组子在指示平板上通过颜色反应加以检测。此两个载体的多克隆位点区含有多种内切酶位点,此很容易来构建嵌套缺失位点。pGEMR-T Easy载体系统的多克隆位点两侧都存在EcoRⅠ、BstZⅠ、NotⅠ,因此该载体可通过这三类酶进行单酶切构而建重组片断; 而pGEMR-T载体系统的多克隆区两侧都有BstZⅠ酶切序列,因此用此酶进行单酶切操作,即可释放出可插入位点。除了单酶切外,这两类载体都可通过双酶切操作来形成插入位点。pGEMR-T及pGEMR-T Easy载体系统中都有嗜菌体f1的复制起始区,借此可以合成单链DNA。并可用双重反向启动子(T7,SP6)进行体外转录。在pGEMR-T系列载体系统中,外源片断的克隆将打破载体中的β半乳糖苷酶的编码序列,因此重组子可在指示平板上用颜色反应加以筛选。将外源片断克隆到pGEMR-T载体中,然后再转入感受态细胞,这样在指示平板上蓝白斑的比例将下降,在通常情况小,外源片断的插入将产生白斑,但在某些情况小,含重组子的载体也能形成蓝斑,这主要是插入片断长度(包括3`A突出末端)为3`核苷酸的倍数,且插入位点在lacZ基因的阅读框内,并插入片断不含终止密码子。这样就可能不破坏阅读框而翻译出含β半乳糖苷酶N端多肽片断的融合蛋白,与宿主菌的C端片断发生α-互补而形成蓝斑。有文献报道当重组的外源DNA片断接近2Kb时,其可能会克隆到阅读框,并产生蓝斑。即使实验中预设扩增片断并非3`核苷酸倍数,但扩增过程可能会导致核苷酸突变(缺失突变或点突变),这种片断与pGEMR-T系列载体重组后,再转化到感受态细胞中后,即有可能产生蓝斑。这点已有文献报道，因此在筛选重组菌斑时要特别注意。