激活的淋巴细胞内细胞因子的检测

2019.4.29

zhaochenxu

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简介

细胞因子是可溶性蛋白，在淋巴细胞应答中有重要的免疫调节作用。细胞因子可以调节细胞生长、分化以及一系列功能，并且介导正常与病理性免疫应答。细胞因子是具有效应及调节双重作用的独特蛋白。近来研究显示，细胞因子可以具有多重功能，作用于多个细胞亚群并可在不同亚群细胞表达。

早期细胞因子表达与T细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用T淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－g)与TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但这些研究很难外推，因为T细胞克隆与体内T细胞功能相关性还未被揭示。

近来，Jung与Picker采用了Brefeldin(BFA)与monensin等药物预孵检测胞内细胞因子的表达的方法。这一方法阻断了胞内高尔基体介导的转运使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。使用特定刺激剂研究细胞因子应答是细胞因子研究中的重大进展。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。

胞内流式分析法基于目前BD的FastIMMUNE Cytokine System。抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌。此分析采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。

检测方法

图一显示了该方法主要步骤。

尽管方法简单快速，免疫功能检测要求激活过程与激活剂仔细制备、储存与使用，因此该方法包括了BD研究组特殊推荐的激活步骤。成功地激活对得到可信的结果非常重要，因此在细胞收集与制备过程中必须排除可能干扰正常激活过程的因素。避免使用络合钙的抗凝剂ACD与EDTA，因为它会限制钙依赖性激活过程，此外LPS，一种常见的生物试剂污染物，是强细胞激活剂，可能会混淆试验结果。我们建议完全依照此方法，首先从正常血样分析开始，再进行异常样本的分析或更改试验条件。

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图1、 FastIMMUNE胞内细胞因子检测步骤

一、仪器设备

1．12×75mm有盖的Falcon管(BD Catalog No.2058)
2．37℃孵箱7%CO2
3．混匀振荡器
4．离心机
5．加样器、Tips
6．FACS流式细胞仪

二、细胞

1、全血

使用肝素钠抗凝的VACUTAINER真空采血管(BD VACUTAINER Catalog No.367673), FastIMMUNE不易采用肝素锂，EDTA和ACD抗凝剂，血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。

2、自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)

使用肝素钠抗凝的BD VACUTAINER 细胞制备管(CPTs)(BD VACUTAINER Catalog No.362753)24小时内分析。

3、组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)

用Ficoll分离PBMCs，调节细胞浓度2×10⁶细胞/mL于含10%热灭活胎牛血清(FBS)的RPMI－1640。

4、细胞系与T细胞克隆

调节细胞浓度2×10⁶细胞/mL于新鲜培养基中。

5、冰冻全血与PBMCs

应用1×FACS溶血素，溶血固定激活全血或PBMCs用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS，冻存－70℃。溶化后细胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，离心5分钟500g，然后用FACS通透液通透与染色。

三、选择、制备、储存试剂

激活剂(BD 不提供)
1．Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)(Sigma Cataog No.P-8139)
    a. 于DMSO中调节浓度0.1mg/mL
    b. 分装(20mL)，－20℃储存。勿反复冻融
    c. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：100稀释储存液
    d. PMA终浓度25ng/mL细胞悬液。

2．Ionomycin (sigma Catalog No.I-0634)

a. 于乙醇中配制成浓度0.5mg/mL
b. －20℃储存。
c. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液
d. Ionomycin终浓度1mg/mL细胞悬液。

3．Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (sigma Catalog No.S-4881)

a. 无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL
b. 4℃储存。
c. SEB终浓度10mg/mL细胞悬液。

4．Brefeldin-A(BFA) (sigma Catalog No.B-7651)

a. 于DMSO中调节浓度5mg/mL
b. 分装(20mL)，－20℃储存。勿反复冻融。
c. 每次实验用无菌无叠氮钠PBS 1：10稀释储存液
d. 激活最后4－5小时BFA终浓度10mg/mL细胞悬液。

注意：BFA过度孵育会导致细胞活力下降。

5．不含谷氨酰胺的RPMI-1640

6．无菌无叠氮钠PBS

7．DMSO(sigma Catalog No.D－8779)

8．乙醇

9．洗液，含0.5%BSA与0.1%NaN3 , 4℃储存。

10．含1%多聚甲醛的PBS，4℃储存。

11.细胞表面染色的标记荧光单抗试剂

依据实验需要选择特殊表面标志

CD45-PerCP圈定所有淋巴细胞
CD3-PerCP圈定T淋巴细胞
CD4-PerCP或CD8-PerCP圈定特定T淋巴细胞亚群
CD19-PerCP或CD20-PerCP圈定B淋巴细胞
CD56-PerCP圈定NK淋巴细胞
CD14-PerCP圈定单核细胞

12.FACS溶血素

FACS溶血素(BDIS Catalog No.349202)用于PBMCs，培养细胞与全血制备，主要有3个作用：
    1、全血制备时用于溶解红细胞
    2、固定外表位
    3、辅助通透剂
FACS溶血素使用前用无离子水1：10稀释，勿用PBS或其它缓冲液。

13.FACS通透液

BD推出FACS通透液(BDIS Catalog No.340457)以确保灵敏性及降低染色背景。此试剂独特之处在于它能克服皂素等其他胞内染色常用通透剂的不足。(由于皂素是植物提取物，组分不均一，常会带来胞内染色的变异)FACS通透液另一优点是它能免除某些方法为增加通透性所需冷冻细胞过夜的步骤。
FACS通透液使用前用无离子水1：10稀释，勿用PBS或其它缓冲液。

14．细胞内染色的标记荧光单抗试剂

依据实验需要选择特殊胞内标志。例如，双色标记IFNg-FITC/IL-4PE与CD3PerCP组合是同时研究TH1与TH2型免疫反应常用选择。成功的胞内染色有赖于抗体与胞内靶位强效结合，胞内检测使用BFA等分泌抑制剂检测蛋白在高尔基体的转运，当然，此时蛋白与分泌型蛋白会有不同，因此用于检测胞外细胞因子的抗体可能无法进行胞内检测。BD在胞内分析条件下筛选了大量抗体供胞内分析使用。

四、激活

激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内。未刺激对照也应包含BFA。激活过程在有盖的Falcon管中进行，所有试剂浓度都为在激活混合物中的终浓度。

1、 PMA+inonmycin(PMA+I)

a．全血或PBMCs用无血清的RPMI1640 1：1稀释(此稀释只适用PMA+I激活，细胞浓度2×10⁶/mL则无须稀释)
b．25ng/mL PMA(25mL工作液/mL全血)，1mg/mL inonmycin(20mL工作液/mL全血)，10mg/mLBFA(20mL工作液/mL全血)共刺激
c．37℃，7%CO₂ ，4小时孵育(最好用培养箱，松盖，可控制PH值；若用水浴需旋紧盖子。)